2024/10/03 更新

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キマタ ナオキ
木股 直規
所属
理工学術院 大学院先進理工学研究科
職名
講師(任期付)

経歴

  • 2024年09月
    -
    継続中

    早稲田大学   大学院先進理工学研究科   講師(任期付)

所属学協会

  • 2022年06月
    -
    継続中

    日本動物学会

 

論文

  • Retinal orientation and interactions in rhodopsin reveal a two-stage trigger mechanism for activation.

    Naoki Kimata, Andreyah Pope, Markus Eilers, Chikwado A Opefi, Martine Ziliox, Amiram Hirshfeld, Ekaterina Zaitseva, Reiner Vogel, Mordechai Sheves, Philip J Reeves, Steven O Smith

    Nature communications   7   12683 - 12683  2016年09月  [国際誌]

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    The 11-cis retinal chromophore is tightly packed within the interior of the visual receptor rhodopsin and isomerizes to the all-trans configuration following absorption of light. The mechanism by which this isomerization event drives the outward rotation of transmembrane helix H6, a hallmark of activated G protein-coupled receptors, is not well established. To address this question, we use solid-state NMR and FTIR spectroscopy to define the orientation and interactions of the retinal chromophore in the active metarhodopsin II intermediate. Here we show that isomerization of the 11-cis retinal chromophore generates strong steric interactions between its β-ionone ring and transmembrane helices H5 and H6, while deprotonation of its protonated Schiff's base triggers the rearrangement of the hydrogen-bonding network involving residues on H6 and within the second extracellular loop. We integrate these observations with previous structural and functional studies to propose a two-stage mechanism for rhodopsin activation.

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  • Free backbone carbonyls mediate rhodopsin activation.

    Naoki Kimata, Andreyah Pope, Omar B Sanchez-Reyes, Markus Eilers, Chikwado A Opefi, Martine Ziliox, Philip J Reeves, Steven O Smith

    Nature structural & molecular biology   23 ( 8 ) 738 - 43  2016年08月  [国際誌]

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    Conserved prolines in the transmembrane helices of G-protein-coupled receptors (GPCRs) are often considered to function as hinges that divide the helix into two segments capable of independent motion. Depending on their potential to hydrogen-bond, the free C=O groups associated with these prolines can facilitate conformational flexibility, conformational switching or stabilization of the receptor structure. To address the role of conserved prolines in family A GPCRs through solid-state NMR spectroscopy, we focus on bovine rhodopsin, a GPCR in the visual receptor subfamily. The free backbone C=O groups on helices H5 and H7 stabilize the inactive rhodopsin structure through hydrogen-bonds to residues on adjacent helices. In response to light-induced isomerization of the retinal chromophore, hydrogen-bonding interactions involving these C=O groups are released, thus facilitating repacking of H5 and H7 onto the transmembrane core of the receptor. These results provide insights into the multiple structural and functional roles of prolines in membrane proteins.

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    16
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    (Scopus)
  • Uncovering the triggers for GPCR activation using solid-state NMR spectroscopy.

    Naoki Kimata, Philip J Reeves, Steven O Smith

    Journal of magnetic resonance (San Diego, Calif. : 1997)   253   111 - 8  2015年04月  [国際誌]

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    G protein-coupled receptors (GPCRs) span cell membranes with seven transmembrane helices and respond to a diverse array of extracellular signals. Crystal structures of GPCRs have provided key insights into the architecture of these receptors and the role of conserved residues. However, the question of how ligand binding induces the conformational changes that are essential for activation remains largely unanswered. Since the extracellular sequences and structures of GPCRs are not conserved between receptor subfamilies, it is likely that the initial molecular triggers for activation vary depending on the specific type of ligand and receptor. In this article, we describe NMR studies on the rhodopsin subfamily of GPCRs and propose a mechanism for how retinal isomerization switches the receptor to the active conformation. These results suggest a general approach for determining the triggers for activation in other GPCR subfamilies using NMR spectroscopy.

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    (Scopus)
  • Sequential structural changes in rhodopsin occurring upon photoactivation.

    Naoki Kimata, Andreyah Pope, Dawood Rashid, Philip J Reeves, Steven O Smith

    Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)   1271   159 - 71  2015年  [国際誌]

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    We describe the use of solid-state magic angle spinning NMR spectroscopy for characterizing the structure and dynamics of dark, inactive rhodopsin and the active metarhodopsin II intermediate. Solid-state NMR spectroscopy is well suited for structural measurements in both detergent micelles and membrane bilayer environments. We first outline the methods for large-scale production of stable, functional rhodopsin containing (13)C- and (15)N-labeled amino acids. The expression methods make use of eukaryotic HEK293S cell lines that produce correctly folded, fully functional receptors. We subsequently describe the basic methods used for solid-state magic angle spinning NMR measurements of chemical shifts and dipolar couplings, which provide information on rhodopsin structure and dynamics, and describe the use of low-temperature methods to trap the active metarhodopsin II intermediate.

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  • The C-terminus of the G protein α subunit controls the affinity of nucleotides.

    Naoki Kimata, Takahiro Yamashita, Take Matsuyama, Yasushi Imamoto, Yoshinori Shichida

    Biochemistry   51 ( 13 ) 2768 - 74  2012年04月  [国際誌]

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    The C-terminus of the G protein α subunit has a well-known role in determining the selective coupling with the cognate G protein-coupled receptor (GPCR). In fact, rhodopsin, a prototypical GPCR, exhibits active state [metarhodopsin II (MII)] stabilization by interacting with G protein [extra formation of MII (eMII)], and the extent of stabilization is affected by the C-terminal sequence of Gα. Here we examine the relationship between the amount of eMII and the activation efficiency of Gi mutants whose Giα forms have different lengths of the C-terminal sequence of Goα. The results show that both the activation efficiencies of Gi and the amounts of eMII were affected by mutations; however, there was no correlation between them. This finding suggested that the C-terminal region of Gα not only stabilizes MII (active state) but also affects the nucleotide-binding site of Gα. Therefore, we measured the activation efficiency of these mutants by MII at several concentrations of GDP and GTP and calculated the rate constants of GDP release, GDP uptake, and GTP uptake. These rate constants of the Gi mutants were substantially different from those of the wild type, indicating that the replacement of the amino acid residues in the C-terminus alters the affinity of nucleotides. The rate constants of GDP uptake and GTP uptake showed a strong correlation, suggesting that the C-terminus of Giα controls the accessibility of the nucleotide-binding site. Therefore, our results strongly suggest that there is a long-range interlink between the C-terminus of Giα and its nucleotide-binding site.

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  • G Protein Subtype Specificity of Rhodopsin Intermediates Metarhodopsin Ib and Metarhodopsin II

    Takefumi Morizumi, Naoki Kimata, Akihisa Terakita, Yasushi Imamoto, Takahiro Yamashita, Yoshinori Shichida

    PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY   85 ( 1 ) 57 - 62  2009年01月  [査読有り]

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    Rhodopsin is one of the members of the G protein-coupled receptor family that can catalyze a GDP-GTP exchange reaction on the retinal G protein transducin (Gt) upon photon absorption. There are at least two intermediate states, meta-Ib and meta-II, which exhibit direct interaction with Gt. Meta-Ib binds to GDP-bound Gt, while meta-II forms a complex with Gt having no nucleotide, suggesting that meta-Ib is a state that initially interacts with Gt. Here we investigated whether or not meta-Ib exhibits specific interaction with G protein similar to meta-II, by examining the binding efficiencies of meta-Ib and meta-II to Gi alpha and its mutants whose C-terminal 11 amino acids were replaced with those of Go alpha, Gq alpha and Gs alpha. The affinity of meta-Ib to the C-terminal 11 amino acids of Gt alpha was similar to those of Gi alpha and its mutant with Go alpha's C-terminal 11 amino acids, whereas meta-II exhibited affinity to the C-terminal 11 amino acids of Gi alpha mutant with Go alpha's C-terminal 11 amino acids about half of what was seen for Gt alpha and Gi alpha. Both intermediates exhibited no affinity to the Gi alpha mutants containing the C-terminal 11 amino acids of Gq alpha and Gs alpha. These results suggested that meta-Ib is the state that exhibits specific interaction with G protein as meta-II does, although meta-Ib exhibits a slightly lenient binding selectivity compared to that of meta-II.

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共同研究・競争的資金等の研究課題

  • 光感受性網膜神経節細胞のシグナル伝達系による非視覚光応答の制御メカニズムの解析

    日本学術振興会  科学研究費助成事業

    研究期間:

    2022年04月
    -
    2025年03月
     

    木股 直規

  • 光受容分子OPN4の活性化メカニズムの解析およびその生理的意義の解明

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 若手研究

    研究期間:

    2019年04月
    -
    2022年03月
     

    木股 直規

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    本研究では、メラノプシンの分子特性が生体の光応答に与える影響を解明することを目的としている。本年度は、変異型メラノプシンを発現するマウスを作製する実験系、具体的には、過去の文献(Hatori et al. (2016) plos one)にしたがって、アデノ随伴ウイルス(AAV)をメラノプシン遺伝子をCre遺伝子に置換した変異マウス系統(Opn4Creマウス)に導入する系を確立した。まず、遺伝子組換え酵素Cre依存的にメラノプシンを発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)を作製し、このAAVをOpn4Creマウスの眼球に注射した。その結果、AAVを注射したマウス網膜の一部の神経節細胞において、AAVによって発現誘導されたメラノプシン分子が検出された。次に、この方法でマウス網膜に発現したメラノプシンが、マウスの光生理応答を引き起こすかどうかを検証した。具体的には、Opn4Creマウスを、遺伝的に視細胞が変性するマウス系統(rdマウス)と交配し、遺伝的に光生理応答しないマウス(Opn4Cre;rdマウス)を作製した。このマウスの眼球に上で作製したAAVを注射し、このマウスの瞳孔が光によって収縮するかどうか(瞳孔反射)を測定した。その結果、AAVを眼球に注射したOpn4Cre;rdマウスにおいて、野生型マウスとほぼ同様の瞳孔反射が確認された。これらの結果から、変異型メラノプシンをマウス網膜に発現させ、このようにして作製した変異型マウスについて光生理機能を検証する実験系が確立できたと言える。

  • 体内時計の光入力系に関わる光受容分子OPN4の活性化メカニズムの解析

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 研究活動スタート支援

    研究期間:

    2018年08月
    -
    2020年03月
     

    木股 直規

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    非視覚系の光応答を担う光受容分子OPN4の活性化メカニズムをアミノ酸残基レベルで解明するため、マウスOPN4の変異体解析を行っている。着目したアミノ酸残基がOPN4の光活性化メカニズムに重要であることを確かめるには、発現するOPN4分子数に対する細胞の光応答を測定する必要がある。そこで、細胞に発現した野生型と変異型OPN4の発現量を比較するため、C末端に蛍光タンパク質mCherryが結合したOPN4(OPN4-mCherry)を作製した。OPN4-mCherryを発現させた培養細胞の光応答を観測したところ、野生型OPN4を発現させたものと同様の光応答を示したことから、OPN4-mCherryを変異体解析のコントロールに使用できることがわかった。そこで、脊椎動物ロドプシンの光活性化に重要なアミノ酸残基であるY191およびY268に着目し、これらに相当するOPN4のアミノ酸残基(Y224およびY309)についての変異体(Y224FおよびY309F)を作製した。これらの変異体を培養細胞に遺伝子導入したところ、両変異体ともに発現が確認できた一方で、野生型を発現した細胞とは異なる光応答を示した。この結果から、Y224およびY309がOPN4の光活性化メカニズムに関わるアミノ酸残基であることを見出した。
    また、OPN4の光活性化メカニズムの生理的な意義を見出すため、アデノ随伴ウイルス(AAV)を用いてマウスの光感受性網膜神経節細胞(ipRGC)に変異体OPN4を発現させることを計画している。そのために、まずは感染した細胞で組み換え酵素Cre依存的に野生型OPN4-mCherryを発現させるAAVを作製した。その結果、マウスipRGCに感染させる上で十分な力価のAAVを得られた。

 

現在担当している科目

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特定課題制度(学内資金)

  • ニワトリクリプトクロム4による視覚シグナル伝達効率への影響の解析

    2022年  

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    渡り鳥を含む一部の生物は、地磁気を感知して行動の選択に利用している。地磁気を感知するための分子として、青色光を受容するタンパク質であるクリプトクロム4(CRY4)が候補として考えられているが、CRY4で受け取った磁気信号を細胞としてどのように処理するかはまだ不明である。申請者は、ニワトリのCRY4が網膜の赤色錐体視細胞に発現することに着目し、CRY4が磁気によって視覚を変化させる可能性を考えた。そこで、本課題ではCRY4が視覚のシグナル伝達系に与える影響について検証した。その結果、CRY4が視覚系に関わる分子の1つであるトランスデューシンを活性化することが示唆された。この結果から、一部の生物は地磁気を捉えるのに視覚のシグナル伝達系を用いている可能性が考えられる。