Culturing three-dimensional (3D) tissues with an appropriate microenvironment is a critical and fundamental technology in broad areas of cutting-edge bioengineering research. In addition, many technologies have engineered tissue functions. However, an effective system for transporting nutrients, waste, or oxygen to affect the functions of cell tissues has not been reported. In this study, we introduce a novel system that employs diffusion and convection to enhance transportation. To demonstrate the concept of the proposed system, three layers of normal human dermal fibroblast cell sheets are used as a model tissue, which is cultured on a general dish or porous collagen scaffold with perfusable channels for three days with and without the perfusion of culture media in the scaffold. The results show that the viability of the cell tissue was improved by the developed system. Furthermore, glucose consumption, lactate production, and oxygen transport to the tissues were increased, which might improve the viability of tissues. However, mechanical stress in the proposed system did not cause damage or unintentional functional changes in the cultured tissue. We believe that the introduced culturing system potentially suggests a novel standard for 3D cell cultures.

Three-dimensional (3D) cardiac tissue reconstruction using tissue engineering technology is a rapidly growing area of regenerative medicine and drug screening development. However, there remains an urgent need for the development of a method capable of accurately measuring the contractile force of physiologically relevant 3D myocardial tissues to facilitate the prediction of human heart tissue drug sensitivity. To this end, our laboratory has developed a novel drug screening model that measures the contractile force of cardiac cell sheets prepared using temperature-responsive culture dishes. To circumvent the difficulties that commonly arise during the stacking of cardiomyocyte sheets, we established a stacking method using centrifugal force, making it possible to measure 3D myocardial tissue. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes were seeded in a temperature-responsive culture dish and processed into a sheet. The cardiac cell sheets were multilayered to construct 3D cardiac tissue. Measurement of the contractile force and cross-sectional area of the multilayered 3D cardiac tissue were then obtained and used to determine the relationship between the cross-sectional area of the cardiac tissue and its contractile force. The contractile force of the 1-, 3-, and 5-layer tissues increased linearly in proportion to the cross-sectional area. A result of 6.4 mN/mm2, accounting for one-seventh of the contractile force found in adult tissue, was obtained. However, with 7-layer tissues, there was a sudden drop in the contractile force, possibly because of limited oxygen and nutrient supply. In conclusion, we established a method wherein the thickness of the cell sheets was controlled through layering, thus enabling accurate evaluation of the cardiac contractile function. This method may enable comparisons with living heart tissue while providing information applicable to regenerative medicine and drug screening models.

組織や臓器を細胞から作製する組織工学は臓器移植への応用が期待されているが、臓器特有の機能を有する立体組織の作製は未だ研究段階である。血管網の付与、及び付与した血管網への培養液の灌流により立体心筋組織を作製可能であることが報告されているが、1 mmを超える組織を安定的に作製する手法については未確立である。
そこで本研究では、付与した血管網への培養液の灌流方法として生体内において末梢循環の向上に寄与することが知られている拍動流に着目した。拍動流を創出、組織内の微細な毛細血管へと灌流可能なバイオリアクタを開発し、拍動流が①組織内の培養液の灌流領域に与える影響、②組織内での血管網形成に与える影響を、定常流による灌流培養と比較することで明らかにし、立体組織構築のための最適な灌流培養手法を提案することを目的とする。
本年度は、立体組織構築の基盤となる培養土台である新たな血管床の開発に着手した。血管床とは微細な流路を有する組織であり、細胞シートを血管床上に生着させた後に灌流培養することで、血管床内の流路を介して直径約数十マイクロメートルの細胞シート内血管網へ培養液を送液し、立体組織の構築を可能とする。前年度まで血管床として採用していた生体由来の組織を利用した血管床は、細胞シート内血管網への送液が可能であることを明らかとした一方、材料の特性に起因する組織構造の問題などから再現性が低いことが明らかとなった。そこで本年度では血管床内の流路と細胞シートの血管網間での流路結合の再現性の高い血管床を、ハイドロゲルを用いて人工的に作製する手法の開発に取り組んだ。ハイドロゲル濃度や血管床形状の検討により細胞シート内毛細血管網への培養液の送液を高い再現性を持って可能にする血管床を開発した。これにより灌流培養手法が組織内の血管網に与える影響の評価を可能とした。

本研究では、生体外において組織工学的に作製した高細胞密度の立体組織に対して培養液等が灌流可能な血管網を大量に付与する技術の開発を目的とする。立体組織への灌流可能な血管網の導入に向け、培養液の流動を立体組織に直接加えることが可能な流路構造を有する、新たな血管床を開発した。細胞シートの重層化によって得られた立体組織を開発した血管床上で灌流培養することで、培養液や血液の灌流が可能な機能的血管網を生体外において大量に付与可能であることを明らかにし、以上の結果をMicrovascular Research誌に投稿した。本実験系は、これまでにない再生医療組織や創薬試験モデルの応用研究に資する知見を提供可能であると期待される。