細胞メモリーに関わるポリコーム遺伝子群ESC-E(Z) 複合体について、メダカをモデルとして機能解析を行いhedgehogシグナリングへの関与を明らかにした。機能欠損が致死になるため、他のシステムでは困難であったESC-E(Z)複合体の機能解析を、morpholino antisense oligo (MO)を用いたノックダウンの手法により可能にした。oleed（esc相同遺伝子）およびolezh2 (E(z)相同遺伝子）のノックダウン実験において単眼奇形cyclopiaを見いだした。さらに、cyclopiaがESC-E(Z)複合体全体の機能欠損により生じることを示した。ESC-E(Z)複合体機能欠損胚においてhedgehogシグナリングの標的遺伝子であるspaltの腹側中枢神経系における減少と、Pax2の眼茎における消失を認めた。通常shh過剰発現胚においてはspaltなどのhedgehog標的遺伝子は発現領域の拡張を示すが、shh過剰発現とESC-E(Z)複合体の機能欠損を同時に起こした胚においては発現領域の拡張は見られなかった。この結果は、ESC-E(Z)複合体がhedgehogシグナリングの受け手の細胞内において重要な役割を果たしているという仮説を支持する。この仮説をさらに検証するため、in vitro実験として、マウス培養細胞NIH-3T3をShhペプチド添加条件で培養しヒストンH3のメチル化の上昇を確認した。この結果は、ESC-E(Z) 複合体のhedgehogシグナリングへの関与はメダカのみならず、広く生物界において見られることを示唆する。さらに、in vivo実験として、メダカ胚を用いてhedgehogシグナリングの阻害によりヒストンH3のメチル化の減少を確認した（Shindo et al., 2004; Shindo et al., 2005)。

ゲノムプロジェクトの大要が終焉を迎え、遺伝子研究の主流は、エピジェネティックな遺伝子発現機構の研究へとシフトした。エピジェネティクスの諸相において、遺伝子がネットワークを形成して作用していることを反映して、タンパク質複合体の分離と同定が刻々と報告されている。我々は、このような観点からこの１０年来ポリコーム遺伝子群( PcG と略す)に着目し、in vivo機能解析を進めてきた。 近年の盛んな研究にも拘わらず不明な点が多い。以下に我々の研究の成果を３つに分けて記述する。(1) 我々はマウスPcGタンパク質M33の細胞内動態について新しい知見を得た。マウス肝臓では、M33は定常状態では細胞質に局在しており 、肝 再生によりリン酸化を受け、かつ核に移行する。肝再生が終了するとふたたび細胞質へ移行するというダイナミック・シャトリングを示す ことが判明した。(2) ゼブラフィッシュよりPcGホモログを７種クローン化し構造を決定した。このうち３種について実験を進めた。pc1とpsc1の産物は試験管内 において他種の相互作用のパターンと同様の挙動を示した。ph2については、発現解析に続きMorpholinoアンチセンスオリゴ（MO） による 遺伝子ノックダウンにより、体節形成に重要な役割を果たしていることを示した。(3) メダカにおいて５種のPcGホモログを分離した。そのひとつ oleedについて、ノックダウン実験により単眼奇形（cyclopia）の誘発を認め た。また、oleedとPcG複合体を形成していると考えられるolezのMOによっても、その複合体が持つと考えられる脱アセチル化酵素の Trichostatin Aによる阻害実験においても同様の奇形が生じた。 OleedがPcG複合体を介して作用していることを強く示唆する。PcG複合 体がHedgehog シグナリングに関与しているという知見も得た。

発生過程における「細胞メモリー」の分子機構を明らかにすることを目的として、マウスおよびゼブラフィッシュのポリコーム相同遺伝子群について研究を行った。① マウスポリコーム相同タンパク質M33について新しい知見を得た。成体マウス肝臓のM33タンパク質の大部分は細胞質に局在し、細胞核にもわずかに認められた。核M33は細胞質M33がリン酸化されたものであった。核M33の電気泳動上の移動度が増殖活性の高いF９細胞のそれと一致することから、細胞増殖、リン酸化、核移行の関連を再生肝を用いて調べた。M33は肝再生において細胞分裂に同調してリン酸化され、かつ核に移行し、再生が終了すると再び細胞質に戻るというダイナミックなシャトリングを示すことが明らかになった。M33タンパク質、さらにはポリコームタンパク質の機能解析に新たな視点を開いた。② ゼブラフィッシュのポリコーム相同遺伝子 pc1, psc1 およびph2 遺伝子について研究を進めた。特に ph2 遺伝子において興味ある知見を得た。この遺伝子はひとつの遺伝子座から ph2αと ph2βの２つのmRNAを転写する。両mRNAは胚発生において体節に特徴的な発現を示した。すなわちβがまず発現し、次いでαがそれに続いた。１個の体節レベルで見るとαは後方から前方にかけて発現の強度勾配を、βは逆の勾配を示した。モルフォリーノ・アンチセンス・オリゴを胚に顕微注入してβの発現を阻害すると、予期したとおり遅筋の形成障害とそれを反映する尾部の彎曲が認められた。pc1, psc1 は、特徴ある発現パターンを示さないが、それぞれのタンパク質は核に局在し、タンパク質レベルで相互に、またそれ自身と結合することが明かとなった。これらの知見は、ゼブラフィッシュにおいてもポリコーム遺伝子群が存在し、「細胞メモリー」機構においてその機能を発揮していることを示している。

（１）マウスPcG相同遺伝子のひとつM33遺伝子の下流遺伝子群を探索し、候補遺伝子を数個見い出した。M33ノックアウトマウスと野生型マウスについてDifferential Display 法により発現パターンの異なる遺伝子を探索した。13.5日胚、生体組織、樹立した培養細胞より抽出したRNAについて蛍光検出による Differential Display 法を約300対のプライマーセットについて行った。見い出された遺伝子について現在性状決定を進めている。（２）PcG遺伝子 の機能解明を多角的かつ相補的に進めるため、ゼブラフィッシュのPcG相同遺伝子の単離を試み、ショウジョウバエのPc, ph, Pscに対応する３種の構造的相同遺伝子をクローン化した。これらの遺伝子よりコードされるタンパク質間の相互作用を試験管内で調べたところ、ショウジョウバエ、マウス、カエルにおいて見られたのと同様の挙動を示し、機能的にも相同である可能性を強く示唆した。このことは魚類においてもPcG遺伝子群が遺伝子発現パターンの維持、さらには発生における「決定」機構に関与していることを示す。（３）核タンパク質と考えられていたM33タンパク質が肝臓においては細胞質に局在しており、肝臓細胞が増殖期に入るとリン酸化を受け、かつ核に移行することを見い出した。M33タンパク質はその大部分が静止期の肝臓では細胞質に局在している。核にはごく微量存在し、かつ電気泳動的に移動度が遅い。核に存在する分子種をアルカリフォスファターゼ処理すると細胞質に局在するM33分子と同じ移動度を持つ分子に変化した。肝部分切除を行ったマウスについて調べたところ、細胞の増殖に対応して移動度の変化が認められた。肝切除72時間後、細胞の増殖が低下すると移動度の早い分子種が再び現われた。M33タンパク質は機能時にリン酸化を受け核へ移行し他のPcGタンパク質と複合体を形成すると考えられる。

発生過程で各細胞系譜に分岐した細胞においては通常分裂後においても分裂前の遺伝子発現状態を安定に維持している。この現象は「セル・メモリー」とも呼ばれ「発生における決定」の基本相をなすと考えられてきたがその分子機構は全くわかっていない。最近、ショウジョウバエのPolycomb遺伝子群(Pc-G)およびtrithorax遺伝子群(trx-G）がこの維持機構に関与していることが示唆され、かつ、この遺伝機構の普遍性を反映して、ヒト、マウス、カエルなど他の生物種からも相同遺伝子が分離されている。われわれはPc-Gのマウス相同遺伝子についてその機能解明を多角的に進めてきた。1997年度においては次の成果を得た。(1)マウスPc-G相同遺伝子によってコードされるタンパク質M33，RAE28，BMI1が細胞核内において複合体を形成していることを免疫沈降法およびゲルろ過法により示した。各タンパク質の相互作用に与る領域を欠失体を用いた酵母Two-Hybrid法により同定した。各タンパク質の胚発生における消長および成体組織における分布パターンより複合体は不均一な組成を持つことを示唆した。(2)M33遺伝子の機能を明らかにするためES細胞を介した相同組み換えによりM33のＣ末を欠失した突然変異体マウスを作製し表現型を解析した。他のマウスPc-G突然変異体で認められた前後軸異常に加えて遺伝子型XYのホモマウスにおける卵巣形成あるいは雌雄同体を認めた。このM33欠失マウスは哺乳動物の性決定機構の解析に好適のモデルを提供すると考えられる。(3)M33の下流遺伝子群を同定するためM33変異体と野生型マウスのRNAについてmRNA Differential Display法による解析を開始した。本実験は昨年度においては方法の確立にその主力を注いだ。今年度において本格的解析段階を迎える。研究成果の発表（予定も含む）Y.Takihara, D.Tomotsune, M.Shirai, Y.Katoh-Fukui, K.Nishii, Md.A.Motaleb, M.Nomura, R.Tsuchiya, Y.Fujita, Y.Shibata, T.HIgashinakagawa and K.Shimada, Targeted disruption of the mouse homologue of the Drosophila polyhomeotic gene leads to altered anteroposterior patterning and neural crest defects, Development, 124, 3673-3682 (1997).N.Hashimoto, H.W.Brock, M.Nomura, M.Kyba, J.Hodgson, Y.Fujita, Y.Takihara, K.Shimada and T.Higashinakagawa, RAE28, BMI1 and M33 are members of heterogeneous multimeric mammalian Polycomb group complexes, Biochem. Biophys. Res. Commun. 245, 356-365(1998)Y.Katoh-Fukui, R.Tsuchiya, T.Shiroishi, Y.Nakahara, N.Hashimoto, K.Noguchi and T.Higashinakagawa, Male to female sex-reversal in M33 mutant mice, Nature,393, 688-692(1998).