2024/12/07 更新

写真a

キムラ イチロウ
木村 一郎
所属
人間科学学術院
職名
名誉教授
学位
理学博士 ( 東京大学 )

所属学協会

  •  
     
     

    日本動物学会

  •  
     
     

    日本細胞生物学会

  •  
     
     

    日本発生生物学会

研究分野

  • 発生生物学
 

書籍等出版物

  • 現代人間科学講座「健康福祉」人間科学

    朝倉書店  2008年 ISBN: 9784254505283

  • オクスフォード動物学辞典

    朝倉書店  2005年

  • 生物学データ百科事典(上・下巻)

    朝倉書店  2002年 ISBN: 9784254171112

共同研究・競争的資金等の研究課題

  • 細胞の増殖,分化,死の制御機構

  • -

Misc

  • Phospholipase Cζ mRNA expression and its potency during spermatogenesis for activation of quail oocyte as a sperm factor.

    Mizushima S, Takagi S, Ono T, Atsumi Y, Tsukada A, Saito N, Shimada K

    Mol.Repro. Dev.   76 ( 12 ) 1200 - 1207  2009年12月

    DOI

  • Phospholipase C zeta mRNA Expression and its Potency During Spermatogenesis for Activation of Quail Oocyte as a Sperm Factor

    Shusei Mizushima, Soichi Takagi, Tamao Ono, Yusuke Atsumi, Akira Tsukada, Noboru Saito, Kiyoshi Shimada

    MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT   76 ( 12 ) 1200 - 1207  2009年12月

     概要を見る

    This study was conducted to investigate the role of a sperm-borne compound in oocyte activation in special reference to the time when oocyte activation is required by testicular cells during spermatogenesis in quail. First, effects of a microinjection of quail sperm extract (SE) and quail phospholipase C zeta (PLC zeta C) cRNA into quail oocytes were assessed by observation of pronuclear formation and cytoplasmic segmentation, respectively. Secondly, the effects of a microinjection of round spermatids with or without PLC zeta cRNA into quail oocytes were studied by observation of development. When the oocytes were injected with SE at 0.13mg protein/ml, both pronuclear formation and cytoplasmic segmentation were optimally induced. However, pronuclear formation was blocked when SE was pretreated with heat or when the oocyte was pretreated with BAPTA (a Ca(2+) chelator) before SE injection. On the other hand, when the oocytes were injected with PLC zeta cRNA at 60 mu g/ml, not only pronuclear formation but also cytoplasmic segmentation were optimally induced. However, PLC zeta cRNA-induced pronuclear formation was blocked by pretreatment with cycloheximide (an inhibitor of protein synthesis) or with BAPTA. Most interestingly, round spermatids alone cannot induce blastodermal development but microinjection of a round spermatid with PLC zeta cRNA can induce development. In addition, RT-PCR revealed that PLC zeta mRNA is expressed in elongated spermatids and testicular sperm but not in round spermatids. It is concluded that PLC zeta is a functional sperm factor for oocyte activation to initiate resumption of meiotic division in quail and its potency is acquired after elongated spermatid formation during the spermatogenesis.

    DOI

  • A balanced diet is necessary for proper entrainment signals of the mouse liver clock.

    Akiko Hirao, Yu Tahara, Ichiro Kimura, Shigenobu Shibata

    PloS one   4 ( 9 ) e6909 - 10  2009年09月   [ 国際誌 ]

     概要を見る

    BACKGROUND: The peripheral circadian clock in mice is entrained not only by light-dark cycles but also by daily restricted feeding schedules. Behavioral and cell culture experiments suggest an increase in glucose level as a factor in such feeding-induced entrainment. For application of feeding-induced entrainment in humans, nutrient content and dietary variations should be considered. PRINCIPAL FINDING: To elucidate the food composition necessary for dietary entrainment, we examined whether complete or partial substitution of dietary nutrients affected phase shifts in liver clocks of mice. Compared with fasting mice or ad libitum fed mice, the liver bioluminescence rhythm advanced by 3-4 h on the middle day in Per2::luciferase knock-in mice that were administered a standard mouse diet, i.e. AIN-93M formula [0.6-0.85 g/10 g mouse BW] (composition: 14% casein, 47% cornstarch, 15% gelatinized cornstarch, 10% sugar, 4% soybean oil, and 10% other [fiber, vitamins, minerals, etc.]), for 2 days. When each nutrient was tested alone (100% nutrient), an insignificant weak phase advance was found to be induced by cornstarch and soybean oil, but almost no phase advance was induced by gelatinized cornstarch, high-amylose cornstarch, glucose, sucrose, or casein. A combination of glucose and casein without oil, vitamin, or fiber caused a significant phase advance. When cornstarch in AIN-93M was substituted with glucose, sucrose, fructose, polydextrose, high-amylose cornstarch, or gelatinized cornstarch, the amplitude of phase advance paralleled the increase in blood glucose concentration. CONCLUSIONS: Our results strongly suggest the following: (1) balanced diets containing carbohydrates/sugars and proteins are good for restricted feeding-induced entrainment of the peripheral circadian clock and (2) a balanced diet that increases blood glucose, but not by sugar alone, is suitable for entrainment. These findings may assist in the development of dietary recommendations for on-board meals served to air travelers and shift workers to reduce jet lag-like symptoms.

    DOI PubMed

  • A balanced diet is necessary for proper entrainment signals of the mouse liver clock.

    Akiko Hirao, Yu Tahara, Ichiro Kimura, Shigenobu Shibata

    PloS one   4 ( 9 ) e6909 - 10  2009年09月   [ 国際誌 ]

     概要を見る

    BACKGROUND: The peripheral circadian clock in mice is entrained not only by light-dark cycles but also by daily restricted feeding schedules. Behavioral and cell culture experiments suggest an increase in glucose level as a factor in such feeding-induced entrainment. For application of feeding-induced entrainment in humans, nutrient content and dietary variations should be considered. PRINCIPAL FINDING: To elucidate the food composition necessary for dietary entrainment, we examined whether complete or partial substitution of dietary nutrients affected phase shifts in liver clocks of mice. Compared with fasting mice or ad libitum fed mice, the liver bioluminescence rhythm advanced by 3-4 h on the middle day in Per2::luciferase knock-in mice that were administered a standard mouse diet, i.e. AIN-93M formula [0.6-0.85 g/10 g mouse BW] (composition: 14% casein, 47% cornstarch, 15% gelatinized cornstarch, 10% sugar, 4% soybean oil, and 10% other [fiber, vitamins, minerals, etc.]), for 2 days. When each nutrient was tested alone (100% nutrient), an insignificant weak phase advance was found to be induced by cornstarch and soybean oil, but almost no phase advance was induced by gelatinized cornstarch, high-amylose cornstarch, glucose, sucrose, or casein. A combination of glucose and casein without oil, vitamin, or fiber caused a significant phase advance. When cornstarch in AIN-93M was substituted with glucose, sucrose, fructose, polydextrose, high-amylose cornstarch, or gelatinized cornstarch, the amplitude of phase advance paralleled the increase in blood glucose concentration. CONCLUSIONS: Our results strongly suggest the following: (1) balanced diets containing carbohydrates/sugars and proteins are good for restricted feeding-induced entrainment of the peripheral circadian clock and (2) a balanced diet that increases blood glucose, but not by sugar alone, is suitable for entrainment. These findings may assist in the development of dietary recommendations for on-board meals served to air travelers and shift workers to reduce jet lag-like symptoms.

    DOI PubMed

  • Dynamic gene expression of Lin-28 during embryonic development in mouse and chicken

    Shigetoshi Yokoyama, Megumi Hashimoto, Hirohito Shimizu, Hiroe Ueno-Kudoh, Kenta Uchibe, Ichiro Kimura, Hiroshi Asahara

    GENE EXPRESSION PATTERNS   8 ( 3 ) 155 - 160  2008年02月

     概要を見る

    The Caenorhabditis elegans heterochronic gene lin-28 regulates developmental timing in the nematode trunk. We report the dynamic expression patterns of Lin-28 homologues in mouse and chick embryos. Whole mount in situ hybridization revealed specific and intriguing expression patterns of Lin-28 in the developing mouse and chick limb bud. Mouse Lin-28 expression was detected in both the forelimb and hindlimb at E9.5, but disappeared from the forelimb at E10.5, and finally from the forelimb, and hindlimb at E11.5. Chicken Lin-28, which was first detected in the limb primordium at stage 15/16, was also downregulated as the stage proceeded. The amino acid sequences of mouse and chicken Lin-28 genes are highly conserved and the similar expression patterns of Lin-28 during limb development in mouse and chicken suggest that this heterochronic gene is also conserved during vertebrate limb development. (c) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

    DOI

  • Dynamic gene expression of Lin-28 during embryonic development in mouse and chicken

    Shigetoshi Yokoyama, Megumi Hashimoto, Hirohito Shimizu, Hiroe Ueno-Kudoh, Kenta Uchibe, Ichiro Kimura, Hiroshi Asahara

    GENE EXPRESSION PATTERNS   8 ( 3 ) 155 - 160  2008年02月

     概要を見る

    The Caenorhabditis elegans heterochronic gene lin-28 regulates developmental timing in the nematode trunk. We report the dynamic expression patterns of Lin-28 homologues in mouse and chick embryos. Whole mount in situ hybridization revealed specific and intriguing expression patterns of Lin-28 in the developing mouse and chick limb bud. Mouse Lin-28 expression was detected in both the forelimb and hindlimb at E9.5, but disappeared from the forelimb at E10.5, and finally from the forelimb, and hindlimb at E11.5. Chicken Lin-28, which was first detected in the limb primordium at stage 15/16, was also downregulated as the stage proceeded. The amino acid sequences of mouse and chicken Lin-28 genes are highly conserved and the similar expression patterns of Lin-28 during limb development in mouse and chicken suggest that this heterochronic gene is also conserved during vertebrate limb development. (c) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

    DOI

  • zeta-Sarcoglycan is a functional homologue of gamma-sarcoglycan in the formation of the sarcoglycan complex

    K Shiga, H Yoshioka, T Matsumiya, Kimura, I, S Takeda, M Imamura

    EXPERIMENTAL CELL RESEARCH   312 ( 11 ) 2083 - 2092  2006年07月

     概要を見る

    The sarcoglycans (SGs), transmembrane components of the dystrophin-associated glycoprotein complex, are stable and functional only when they assemble into a tetrameric complex in muscle cells. A defect in any one of the four SG members disrupts the entire SG complex (SGC) and causes limb-girdle muscular dystrophy zeta-SG has been recently found as a transmembrane protein homologous to gamma-SG and delta-SG. To characterize zeta-SG in complex formation, we co-transfected expression vectors encoding all six SGs (alpha-, beta-, gamma-, delta-, epsilon- and zeta-SG) and dystroglycan into Chinese hamster ovary cells. Immunoprecipitation analysis showed that zeta-SG or gamma-SG formed a SGC with beta-SG and delta-SG plus alpha-SG or epsilon-SG, revealing that zeta-SG can form two types of SGCs (alpha-beta-zeta-delta or epsilon-beta-zeta-delta). This result indicates the functional resemblance of zeta-SG to gamma-SG rather than delta-SG, although phylogenetic analysis suggests that zeta-SG is evolutionally closer to delta-SG than to gamma-SG. Reverse transcription (RT)-PCR showed that the expression pattern of the transcript was almost the reciprocal of that of gamma-SG in various mouse tissues and that the zeta-SG transcript was especially abundant in the brain, suggesting that zeta-SG might play a particular role in the central nervous system. (c) 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.

    DOI PubMed CiNii

  • Immunohistochemical localization of gastrin-releasing peptide receptor in the mouse brain

    S Kamichi, E Wada, S Aoki, M Sekiguchi, Kimura, I, K Wada

    BRAIN RESEARCH   1032 ( 1-2 ) 162 - 170  2005年01月

     概要を見る

    Gastrin-releasing peptide (GRP) is a mammalian bombesin (BN)-like peptide that binds with high affinity to the GRP receptor (GRP-R). Previous behavioral studies using mice and rats showed that the GRP/GRP-R system mediates learning and memory by modulating neurotransmitter release in the local GABAergic network of the amygdala and the nucleus tractus solitarius (NTS). To date, the precise distribution of GRP-R in the brain has not been elucidated. We used a synthetic peptide derived from mouse GRP-R to generate affinity-purified antibodies to GRP-R and used immunohistochemistry to determine the distribution of GRP-R in the mouse brain. The specificity of anti-GRP-R antibody was confirmed in vitro using COS-7 cells transiently expressing GRP-R and in vivo using GRP-R-deficient and wild-type mouse brain sections. GRP-R immunoreactivity was widely distributed in the isocortex, hippocampal formation, piriform cortex, amygdala, hypothalamus, and brain stem. In particular, GRP-R immunoreactivity was observed in the lateral (LA), central, and basolateral amygdaloid (BLA) nuclei and NTS, which are important regions for memory performance. Double-labeling immunohistochemistry demonstrated that subpopulations of GRP-R are present in GABAergic neurons in the amygdala. Consequently, GRP-R immunoreactivity was observed in the GABAergic neurons of the limbic region. These anatomical results provide support for the idea that the GRP/GRP-R system mediates memory performance by modulating neurotransmitter release in the local GABAergic network. (C) 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.

    DOI

  • Comparison of mice deficient in the high- or low-affinity neurotensin receptors, Ntsr1 or Ntsr2, reveals a novel function for Ntsr2 in thermal nociception

    H Maeno, K Yamada, Y Santo-Yamada, K Aoki, YJ Sun, E Sato, T Fukushima, H Ogura, T Araki, S Kamichi, Kimura, I, M Yamano, Y Maeno-Hikichi, K Watase, S Aoki, H Kiyama, E Wada, KJ Wada

    BRAIN RESEARCH   998 ( 1 ) 122 - 129  2004年02月

     概要を見る

    Neurotensin (NT) is a neuropeptide that induces a wide range of biological activities including hypothermia and analgesia. Such effects are mediated by the NT receptors Ntsr1, Ntsr2 and Ntsr3, although the involvement of each receptor in specific NT functions remains unknown. To address nociceptive function in vivo, we generated both Ntsr1-deficient and Ntsr2-deficient mice. In addition, histochemical analyses of both Ntsr1 and Ntsr2 mRNAs were performed in the mouse brain regions involved in NT-related nociception. The expression of Ntsr2 mRNA was greater than that of Ntsr1 in the periaqueductal gray (PAG) and the rostral ventral medulla (RVM). The mutant and control mice were subjected to the examination of thermal nociception, and in the hot plate test, a significant alteration in jump latency was observed in Ntsr2-deficient mice compared to Ntsr1-deficient or wild-type control mice. Latencies of tail flick and hind paw licking of the mutant mice were not affected compared to control mice. These results suggest that Ntsr2 has an important role in thermal nociception compared to Ntsr1, and that these mutant mice may represent a useful tool for the development of analgesic drugs. (C) 2003 Elsevier B.V. All rights reserved.

    DOI

  • Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 binds to and stabilizes monoubiquitin in neuron

    H Osaka, YL Wang, K Takada, S Takizawa, R Setsuie, H Li, Y Sato, K Nishikawa, YJ Sun, M Sakurai, T Harada, Y Hara, Kimura, I, S Chiba, K Namikawa, H Kiyama, M Noda, S Aoki, K Wada

    HUMAN MOLECULAR GENETICS   12 ( 16 ) 1945 - 1958  2003年08月

     概要を見る

    Mammalian neuronal cells abundantly express a deubiquitylating enzyme, ubiquitin carboxy-terminal hydrolase 1 (UCH L1). Mutations in UCH L1 are linked to Parkinson's disease as well as gracile axonal dystrophy (gad) in mice. In contrast to the UCH L3 isozyme that is universally expressed in all tissues, UCH L1 is expressed exclusively in neurons and testis/ovary. We found that UCH L1 associates and colocalizes with monoubiquitin and elongates ubiquitin half-life. The gad mouse, in which the function of UCH L1 is lost, exhibited a reduced level of monoubiquitin in neurons. In contrast, overexpression of UCH L1 caused an increase in the level of ubiquitin in both cultured cells and mice. These data suggest that UCH L1, with avidity and affinity for ubiquitin, insures ubiquitin stability within neurons. This study is the first to show the function of UCH L1 in vivo.

    DOI

  • The AMPA receptor allosteric potentiator PEPA ameliorates post-ischemic memory impairment

    M Sekiguchi, K Yamada, JJ Jin, M Hachitanda, Y Murata, S Namura, S Kamichi, Kimura, I, K Wada

    NEUROREPORT   12 ( 13 ) 2947 - 2950  2001年09月

     概要を見る

    PEPA (4-[2-(Phenylsulphonylamino)ethylthio]-2,6-difluorophenoxyacetamide) is a recently developed allosteric potentiator of AMPA receptors that preferentially affects flop splice variants. We tested the effects of PEPA on ischemia-induced memory deficit in rats. Permanent unilateral occlusion of the middle cerebral artery induced severe impairment of performance of rats in the Morris water maze test. Repeated intravenous administration of PEPA (1, 3, 10 mg/kg/day for 10 days) improved test performance. In contrast, a corresponding dose of aniracetam, a representative potentiator of AMPA receptor, did not significantly improve test performance. Thus, PEPA is more effective than aniracetam in reversing impaired memory function as assessed by the Morris water maze test; and PEPA may be an effective compound for the treatment of impaired memory. NeuroReport 12:2947-2950 (C) 2001 Lippincott Williams & Wilkins.

  • Improved Serum-free defined Medium for Proliferation and Differentiation of Chick Primary Myogenic Cells.

    M.Shiozuka, I.Kimura

    Zool.Sci.   17 ( 2 ) 201 - 207  2000年

    DOI CiNii

  • Developmental Stage-related Sensitivity of Chick Primary Myogenic Cells to Differentiation-inhibiting effect of Activin A.

    M.Shiozuka, I.Kimura

    J.Human Sci.   11 ( 2 ) 56 - 63  1999年

  • Glycosylphosphatidylinositol-Anchored Cell Surface Proteins Regulate Position-Specific Cell Affinity in the Limb Bud.

    N.Wada e

    Dev.Biol.   202 ( 2 ) 244 - 252  1998年

    DOI PubMed CiNii

  • Specific expression of CPP32 in sensory neurons of mouse embryos and

    T.Mukasa

    Biochem.Biophys.Res.Commun.   231 ( 3 ) 770 - 774  1997年

    DOI PubMed CiNii

  • Control of the Limb Bud Outgrowth in Quail-Chick Chimera.

    H.Ohki-Hamazaki

    Dev.Dyn.   208 ( 1 ) 85 - 91  1997年

    DOI

  • Activin A Inhibits Differentiation of Chick Myogenic Cells in Vitro.

    M.Shiozuka

    Zool.Sci.   14 ( 2 ) 327 - 330  1997年

    DOI CiNii

  • Wortmannin Enhances CPP32-like Activity during Neuronal Differentiation

    T.Mukasa

    Biochem.Biophys.Res.Commun.   232 ( 1 ) 192 - 197  1997年

    DOI PubMed CiNii

  • 肢芽間充織細胞の選別をもたらす細胞の性質と,選別に関与する細胞表面分子の探索

    日本発生生物学会第28回大会/日本発生生物学会  

  • ニワトリ培養筋原細胞の分化に対するアクチビンAの効果

    日本発生生物学会第28回大会/日本発生生物学会  

  • ニワトリ培養筋原細胞に対するアクチビンAの効果

    日本動物学会第66回大会/日本動物学会  

  • Sonic hedgehog蛋白の分泌を制御する因子

    日本生化学会第68回大会/日本生化学会  

  • P19EC細胞の神経細胞分化における細胞死におけるFASおよびICEファミリーの関与

    日本レチノイド研究会第6回学術集会/日本レチノイド研究会  

  • P19EC細胞の神経細胞分化における細胞死におけるFASおよびICEファミリーの関与

    日本分子生物学会第18回年会/日本分子生物学会  

  • 発生段階の異なるニワトリ由来の筋原細胞に対するアクチビンAの分化抑制効果

    日本発生生物学会第29回大会  

  • PI-3K阻害剤とTNF/Fasとの協調作用による細胞死とCPP32 活性化

    日本生化学会第69回大会・日本分子生物学会第19回年会合同年会  

  • ニワトリ培養筋原細胞に対するアクチビンAの効果

    日本動物学会第67回大会  

  • FGF-4による後半部を除去した鶏胚肢芽でのShhの発現機構

    日本動物学会第67回大会  

  • 肢芽間充織細胞間の選別はPI-PLC処理により抑制される

    日本発生生物学会第30回大会  

  • 初代培養筋原細胞の分化に対するフォリスタチンの作用

    日本動物学会第68回大会  

  • 培養筋原細胞に対するフォリスタチンの分化促進効果

    日本発生生物学会第31回大会  

  • フォリスタチンは培養筋原細胞の分化を促進する

    日本動物学会第69回大会  

  • 筋発生におけるSPARCの役割

    日本動物学会第70回大会  

  • Follistatin Stimulates Differentiation of Myogenic Cells in Culture.

    Mol.Biol.Cell (38th Annual Meeting of the American Society fro Cell Biology)  

  • A Possible Role of Secreted Protein-acidic and Rich in Cysteine, SPARC, in Myogenesis.

    Mol.Biol.Cell(39th Annual Meeting of the American Society for Cell Biology)  

  • HGF/SFは培養体節筋芽細胞の分散を促進する

    日本発生生物学会第33回大会  

  • HGF/SFは培養体節筋芽細胞の分散を促進する

    日本動物学会第71回大会  

  • HGF/SFは培養体節筋芽細胞の分散を促進するII

    日本動物学会第72回大会  

  • 筋衛星細胞の分化に対するTGF-βの作用

    日本動物学会第74回大会  

  • 体節筋原細胞の移動におけるHGF/SFおよびN-カドヘリンの役割

    日本動物学会第74回大会  

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特定課題制度(学内資金)

  • 鳥類初期胚体節培養系を用いた骨格筋の発生と分化の制御機構に関する研究

    2004年  

     概要を見る

     本研究は,肝細胞成長因子/分散因子(Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor:HGF/SF)が筋前駆細胞の走化性誘引物質かという問題と発生生物学の大きな命題である細胞の「移動」と「接着」の観点から,筋原細胞,特に初期体節由来筋前駆細胞の移動と接着に対するHGF/SFの役割について,ニワトリ3日胚体節組織培養や,タイムラプスビデオ撮影,ホールマウント免疫染色,HGF/SFビーズ移植などを通じて,in vitroおよび in vivoの両方の視点から考察することを目的としたものである。 無処理対照の肢芽部位培養体節腹唇に由来する移動最前縁部の細胞は,紡錘形を呈する筋様細胞と,線維芽細胞様もしくは上皮細胞様の扁平な形状の細胞の混在が認められたが,終濃度10ng/mlでHGF/SF処理をすると,この前縁部の細胞はほとんど紡錘形の筋原細胞となった。これらは,抗デスミン抗体や,抗Myf-5抗体,抗N-カドヘリン抗体を用いた免疫染色の結果から,筋前駆細胞,筋原細胞であることが明らかとなった。タイムラプス映像から, HGF/SFの作用によって,筋前駆細胞の運動性と増殖が顕著に促進されていることが明らかとなり,その運動はラッフリング,葉状仮足の形成と細胞極性をともなう進行方向への細胞伸展という特徴を持つことが分かった。 また,HGF/SFによって筋前駆細胞は分散・移動を亢進されるが,N-カドヘリンを細胞表面,細胞接着面に小斑状に発現し,筋管細胞への融合,分化が抑えられ,移動,接着,解離を絶え間なく繰り返すうちに増殖期に入った。このHGF/SF処理による移動性の亢進,増殖は,抗HGF/SF抗体によって顕著に抑制され,その結果としてN-カドヘリンの細胞間接着面への局在化,Myf-5の核への蓄積を伴う筋芽細胞,筋管細胞への分化が生じた。またこの培養系において,内在性のHGF/SFをあらかじめ無効にする抗HGF/SF抗体で処理すると,筋系譜への移行に障害が生じたと思われる細胞接着が強固な上皮様細胞群が出現した。 これらの結果から,HGF/SFは,上皮様の接着・特性を持つ移動筋前駆細胞が筋系譜へと移行する上皮-間充識転換の局面に何らかの形で関与しており,胚体内の腹唇においては既に筋前駆細胞として発生運命が決定されていると思われるこれら細胞のカドヘリンを介した接着を解くことで,遊走可能な間葉細胞(筋前駆細胞)にし,筋決定をより確実なものにする役割を担っていることが示唆された。さらに,in vitroにおける体節や肢芽の組織培養とその近傍へのHGF/SFビーズ静置実験, および in vivoでの胚体内へのHGF/SFビーズ移植実験などの結果は,HGF/SFが体節筋前駆細胞に対して走化性誘引物質として働いている可能性をより強めるものとなった。

  • 鳥類初期胚体節の培養系を用いた骨格筋の発生と分化の制御機構に関する研究

    2002年  

     概要を見る

     脊椎動物の骨格筋は体節に由来する。しかし,体節の筋前駆細胞の発生と分化がどのような機構により制御されているかについては,詳細は不明である。我々はニワトリ初期胚より採取した体節の培養系というこれまでほとんど試みられたことのない実験系を用いて,そこに存在する筋前駆細胞の発生について,その増殖と分化,さらにその移動において重要な役割を果たしていると考えられている肝細胞成長因子/分散因子(HGF/SF)の作用に注目して調べた。 我々は先ず体節の筋前駆細胞群の分散がHGF/SFにより著しく促進されることをビデオ撮影/タイムラプス法等で確認した。すなわち,体節辺縁から遊出した細胞群中の筋前駆細胞は,HGF/SFの作用を受けるとその運動性がきわめて高められることが示された。また,培養細胞と全胚におけるHGF/SFとその受容体であるC-METの発現について免疫染色した結果から,HGF/SFの作用にはオートクライン/パラクライン機構が関与していることが示唆された。さらに,筋特異タンパク質やPCNAの免疫染色の結果から,筋前駆細胞はHGF/SFにより増殖が促進され,分化が抑制されるらしいことも示唆された。カドヘリンの免疫染色の結果から筋前駆細胞間の接着が緩められることも確認された。また,このようなHGF/SFにより培養体節組織中の筋前駆細胞の分散・移動が亢進されることを確認する中で,これら分散した筋前駆細胞群の中には,その挙動,形態的な特徴などから,HGF/SFに対して強い走化性を示す細胞集団が存在することが強く示唆された。in vitro で筋前駆細胞の走化性が示唆されたのは本研究が初めてであり,古くから大きな関心を持たれてきた筋原細胞の移動の機構の解析において,我々の‘初期胚体節培養系’はきわめて有望なものであると思われる。 現在我々は細胞移動の程度の定量化と低濃度のHGF/SFを結合させたビーズを用いての培養系においてHGF/SFのシグナルに濃度勾配を形成させることなどを試みており,静置した体節組織から分散,遊走してくる筋前駆細胞の移動におけるHGF/SF走化性を再確認する結果を得ている。

  • 骨格筋形成における筋原細胞の融合の機構に関する研究

    2000年  

     概要を見る

     骨格筋筋原細胞はその分化過程において、コミットメントに伴って融合能を獲得するが、その分子機構にはいくつかの可能性が考えられる。本研究は、コミットメント過程において細胞融合に直接関与する細胞膜分子の新生が起こる可能性について検討を加えようとしたものである。これまでに融合能を持つ筋原細胞に特異的な細胞膜タンパク質の同定を試みた研究がいくつかあるが、それらは筋原細胞あるいは細胞融合に特異的なものではなく、おそらくは融合の前過程としての細胞接着に関与する分子に対するものであると思われた。 先ず、ニワトリ胚初代培養筋芽細胞の融合開始期および融合期にあるものについて、その全細胞あるいは粗細胞膜分画をウサギに抗原として投与し、得られた抗血清についてそれらの融合阻止作用を調べ、阻止作用を示すものについて増殖期の細胞あるいは細胞膜分画で吸収することにより、融合を阻止する抗体を含む抗血清標品を得ることを試みた。しかしながら、得られた粗血清がすべて細胞の増殖と分化を著しく阻害することが示され、またその阻害作用は吸収後のものについても示された。何度かにわたる試みにもかかわらず、現在までのところ期待した結果は得られていないが、今後戦略および方法のさらなる検討を行いたいと思っている。 ところで、本研究課題遂行の過程で、生理活性物質、抗体等の作用の検討における無血清培養系の確立の必要性が痛感されたため、これまで初代培養筋芽細胞・衛星細胞、株細胞等の筋前駆細胞の培養で報告されていた無血清培養液と我々の経験をもとにニワトリ胚初代培養筋芽細胞に適した無血清培養液の開発を試みた。その結果、ダルベッコ改変イーグルMEMにウシインスリン、ニワトリトランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト線維芽細胞成長因子-2を加えたものが、筋芽細胞の増殖とそれに続く分化を実現するのに極めて有効であることが判明した(Zool.Sci.17:201-207(2000))。この培養液は今後の筋発生研究にとって価値あるものとなると考えられる。

  • 筋分化におけるアクチビン/フォリスタチン系の役割に関する研究

    1998年  

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     本研究は、筋分化制御因子としてのアクチビン/フォリスタチンの役割について考察することを目的としている。97年度において、発生段階の異なる筋芽細胞のアクチビンに対する応答性の相違に焦点を合わせ、孵卵3.5~15日目のニワトリ胚の筋芽細胞および孵化後3日目の幼鶏の胸筋由来の衛星細胞の初代培養系を用いて、形態学的、免疫化学的、生化学的に発生段階依存的な感受性の変動について調べた結果、アクチビンの筋分化抑制作用については、進んだ発生段階の細胞ほどその感受性が低くなることが示唆された。今年度においては、発生段階がより初期のものについてアクチビン/フォリスタチン系の役割に調べるため、これまで明確な報告がない培養初期体節から遊出してくる筋原細胞による筋発生について調べた。 先ず、その培養系を確立するため、材料とする胚の胚齢、培養液等の培養条件の検討を行った。その結果、胚齢3.5日のものが適当であること、培養条件としては80%DMEM-20%FBS-30ug/ml ニワトリトランスフェリンの増殖培養液中で24時間培養した後に、98%DMEM-2%FBS-30ug/ml ニワトリトランスフェリンの分化培養液に転換するのが適当であることが判明した。この系で調べた結果、体節由来の筋原細胞による筋の発生・分化はアクチビンAによって著しく抑制されること、その感受性は3.5日胚の胸筋由来の筋芽細胞よりもさらに高いことが示された。このことは、アクチビンが筋細胞分化において重要な役割を果たしていることを示唆していると考えられる。 また、フォリスタチンの筋発生促進作用についても、発生段階が初期の細胞ほど高い感受性を示し、体節由来筋原細胞は著しく高い感受性を示すことが示された。

  • 筋分化制御因子としてのアクチビンの役割に関する研究

    1997年  

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    本研究では、筋分化制御因子としてのアクチビンの役割について考察するため、発生段階の異なる筋芽細胞のアクチビンに対する応答性の相違に焦点を合わせ、孵卵3.5、9、11、15日目のニワトリ胚(E3.5、E9、E11、E15)の筋芽細胞および孵化後3日目の幼鶏(PH3)の胸筋由来の衛星細胞の初代培養系を用いて、形態学的、免疫化学的、生化学的に発生段階依存的な感受性の変動について調べた。また、発生の初期から異なる細胞系譜をたどることが知られている胸筋と後肢大腿筋の筋芽細胞についても、アクチビンに対する感受性を調べ比較した。さらに、比較検討のため他の筋分化制御因子についても同様に調べた。 その結果、アクチビンの筋分化抑制作用については、進んだ発生段階の細胞ほど、その感受性が低くなることが示唆された。特に、E3.5体節由来の筋芽細胞は著しく高い感受性を示した。また、同じ発生段階由来の筋芽細胞では、大腿筋よりも胸筋の方がアクチビンに対する感受性が高いことが示唆された。また、その結果は胸筋由来の筋芽細胞よりも大腿筋由来の筋芽細胞の方が、発生段階依存的な変化が先行している可能性を示唆するものであった。これらの結果はアクチビンが筋発生、特にその初期過程において重要な役割を果たしていることを推察させた。 FGFについては、進んだ発生段階の筋芽細胞ほど分化が抑制されることが示され、FGFの作用に対して強い感受性を示す細胞ほど、分裂周期から抜け出すことができず、分化相へのコミットメントが遅れ、結果として筋分化が抑えられることが確認された。 トランスフェリン(Tf)については、胸筋由来の筋芽細胞ではE9からE15のもので、大腿筋由来の筋芽細胞ではE9からE11のもので、発生段階が進むにつれて感受性は高くなることが確認され、また発生初期段階の筋芽細胞においては外因性のTfの存在は生存・増殖・分化に必須であるが、PH3胸筋衛星細胞およびE15大腿筋筋芽細胞では、Tfを与えなくてもかなりの筋管が形成されることが示された。

  • 鳥類筋原細胞の初代培養のための無血清培養液の開発ⅠⅠ

    1996年  

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     1995年度の研究によって、ニワトリ及びウズラの筋原細胞の培養において、ゼラチンを塗布した培養皿中で培養した場合、ダルベッコ変法イーグル最少必須培養液を基礎人工培養液とし、ニワトリトランスフェリンを30ug/ml、ウシインスリンを10ug/ml、ウシ血清アルブミンを1mg/ml、ヒト線維芽細胞成長因子(FGF)-2を10ng/ml加えた無血清培養液(DTIBF)が、一般に鳥類筋原細胞の初代培養に使用される15%馬血清を含む培養液に匹敵する増殖・分化を促進する活性を持っていること、さらにこの無血清培養液系では、初代培養に夾雑を避けられない線維芽細胞の増殖が筋芽細胞に比べて著しく低いことが示された。これらの結果は筋発生研究においてきわめて有効な実験系である初代筋原細胞を無血清系で培養したいという発生生物学者の夢の実現に道を拓くものである。本年度は細胞外マトリクス物質などの効果を調べ、上記の無血清培養液をさらに改善することを試みた。 先ず、いくつかの細胞外マトリクス物質を培養皿に塗布した場合の効果を調べた。Ⅰ型コラーゲン(ラット)、IV型コラーゲン(マウス)、ラミニン(マウス)、フィブロネクチン(ヒト)はいずれもゼラチン塗布の場合に比べると筋分化が促進されたが、その程度は僅かであった。しかし、これらを培養液中に加えた場合、他の3者がそれほど大きな促進作用を示さなかったのに対して、フィブロネクチンは分化を大きく促進した。このフィブロネクチン添加による筋分化促進は、培養皿に予めゼラチンを塗布しておくか否かに関係なく見られた、またこの促進効果はフィブロネクチンの細胞結合部位であるRGD(Arg-Gly-Asp)配列を含むRGD-Ser 合成ポリマー(RGDS)によって競争的に阻害された。 以上の結果から、現時点ではコスト等をも配慮して、上記DTIBF無血清培養液に10ug/mlフィブロネクチンを加えたものが鳥類筋原細胞の培養にきわめて適していると判断した。

  • 鳥類胚筋原細胞の初代培養のための無血清培養液の開発

    1995年  

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    まず,各種動物の筋原細胞およびその他の細胞に対する無血清培養液に関して,これまで蓄積された知見をもとに,基本とすべき培養液系を検討した。一般に無血清培養液系に必須とされ,鳥類筋原細胞の培養においても必須であることが既に我々によって確認されている鳥類由来のトランスフェリン(本実験ではニワトリ卵白トランスフェリン)とすべての動物細胞の培養系において必須であるとされているインスリン(本実験ではウシ由来のもの)を基礎人工合成培養液に加えたものについて調べた。基礎人工合成培養液としてイーグル最少必須培養液,ダルベッコ変法イーグル最少必須培養液,F12培養液などについて調べた結果,ダルベッコ変法イーグル最少必須培養液が最も有効であることが判明した。ダルベッコ変法イーグル最少必須培養液を用いた場合,トランスフェリンは30ug/mlで,インスリンは10ug/mlで筋発生促進効果が飽和に達することがわかった。 上記のダルベッコ変法イーグル最少必須培養液-トランスフェリン-インスリンの系に,以前我々がニワトリ胚抽出液中の筋発生促進因子として確認し,また近年筋発生において最も重要な制御因子として知られるようになった線維芽細胞成長因子(本実験ではウシFGF-2)を添加し,その効果を調べた結果,きわめて有効であることが確認された。線維芽細胞成長因子の濃度については,濃度に依存して筋芽細胞の増殖,筋分化の促進が見られたが,コストの点も考慮して,10ng/mlの濃度を用いることにした。 さらに,動物細胞に無血清培養液に有効なものとしてしばしば用いられてきたウシ血清アルブミンを加えて,その効果を調べたところ,有効であることがわかり,その濃度依存性を調べた結果から,1mg/mlを用いることとした。 以上のような,ダルベッコ変法イーグル最少必須培養液-トランスフェリン-インスリン-線維芽細胞成長因子-血清アルブミンの培養液は,従来一般に鳥類筋原細胞の培養に用いられてきた血清を含む培養液,例えばイーグル最少必須培養液-ニワトリトランスフェリン-ウマ血清(さらにはニワトリ胚抽出液を加えたもの)に比べると,その筋発生促進効果において未だ十分とは言えないものの,かなりの程度の筋発生を実現してくれるものであった。さらに,上記組成の無血清培養液について特筆すべきことは,筋原細胞の初代培養において莢雑を避けられない線維芽細胞の増殖が著しく抑えられることであった。 現在,細胞外基質物質の添加効果を調べているが,フィブロネクチンなどの有効性が示唆されており,さらなる改善を進めている。

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