This study was conducted to investigate the role of a sperm-borne compound in oocyte activation in special reference to the time when oocyte activation is required by testicular cells during spermatogenesis in quail. First, effects of a microinjection of quail sperm extract (SE) and quail phospholipase C zeta (PLC zeta C) cRNA into quail oocytes were assessed by observation of pronuclear formation and cytoplasmic segmentation, respectively. Secondly, the effects of a microinjection of round spermatids with or without PLC zeta cRNA into quail oocytes were studied by observation of development. When the oocytes were injected with SE at 0.13mg protein/ml, both pronuclear formation and cytoplasmic segmentation were optimally induced. However, pronuclear formation was blocked when SE was pretreated with heat or when the oocyte was pretreated with BAPTA (a Ca(2+) chelator) before SE injection. On the other hand, when the oocytes were injected with PLC zeta cRNA at 60 mu g/ml, not only pronuclear formation but also cytoplasmic segmentation were optimally induced. However, PLC zeta cRNA-induced pronuclear formation was blocked by pretreatment with cycloheximide (an inhibitor of protein synthesis) or with BAPTA. Most interestingly, round spermatids alone cannot induce blastodermal development but microinjection of a round spermatid with PLC zeta cRNA can induce development. In addition, RT-PCR revealed that PLC zeta mRNA is expressed in elongated spermatids and testicular sperm but not in round spermatids. It is concluded that PLC zeta is a functional sperm factor for oocyte activation to initiate resumption of meiotic division in quail and its potency is acquired after elongated spermatid formation during the spermatogenesis.

BACKGROUND: The peripheral circadian clock in mice is entrained not only by light-dark cycles but also by daily restricted feeding schedules. Behavioral and cell culture experiments suggest an increase in glucose level as a factor in such feeding-induced entrainment. For application of feeding-induced entrainment in humans, nutrient content and dietary variations should be considered. PRINCIPAL FINDING: To elucidate the food composition necessary for dietary entrainment, we examined whether complete or partial substitution of dietary nutrients affected phase shifts in liver clocks of mice. Compared with fasting mice or ad libitum fed mice, the liver bioluminescence rhythm advanced by 3-4 h on the middle day in Per2::luciferase knock-in mice that were administered a standard mouse diet, i.e. AIN-93M formula [0.6-0.85 g/10 g mouse BW] (composition: 14% casein, 47% cornstarch, 15% gelatinized cornstarch, 10% sugar, 4% soybean oil, and 10% other [fiber, vitamins, minerals, etc.]), for 2 days. When each nutrient was tested alone (100% nutrient), an insignificant weak phase advance was found to be induced by cornstarch and soybean oil, but almost no phase advance was induced by gelatinized cornstarch, high-amylose cornstarch, glucose, sucrose, or casein. A combination of glucose and casein without oil, vitamin, or fiber caused a significant phase advance. When cornstarch in AIN-93M was substituted with glucose, sucrose, fructose, polydextrose, high-amylose cornstarch, or gelatinized cornstarch, the amplitude of phase advance paralleled the increase in blood glucose concentration. CONCLUSIONS: Our results strongly suggest the following: (1) balanced diets containing carbohydrates/sugars and proteins are good for restricted feeding-induced entrainment of the peripheral circadian clock and (2) a balanced diet that increases blood glucose, but not by sugar alone, is suitable for entrainment. These findings may assist in the development of dietary recommendations for on-board meals served to air travelers and shift workers to reduce jet lag-like symptoms.

BACKGROUND: The peripheral circadian clock in mice is entrained not only by light-dark cycles but also by daily restricted feeding schedules. Behavioral and cell culture experiments suggest an increase in glucose level as a factor in such feeding-induced entrainment. For application of feeding-induced entrainment in humans, nutrient content and dietary variations should be considered. PRINCIPAL FINDING: To elucidate the food composition necessary for dietary entrainment, we examined whether complete or partial substitution of dietary nutrients affected phase shifts in liver clocks of mice. Compared with fasting mice or ad libitum fed mice, the liver bioluminescence rhythm advanced by 3-4 h on the middle day in Per2::luciferase knock-in mice that were administered a standard mouse diet, i.e. AIN-93M formula [0.6-0.85 g/10 g mouse BW] (composition: 14% casein, 47% cornstarch, 15% gelatinized cornstarch, 10% sugar, 4% soybean oil, and 10% other [fiber, vitamins, minerals, etc.]), for 2 days. When each nutrient was tested alone (100% nutrient), an insignificant weak phase advance was found to be induced by cornstarch and soybean oil, but almost no phase advance was induced by gelatinized cornstarch, high-amylose cornstarch, glucose, sucrose, or casein. A combination of glucose and casein without oil, vitamin, or fiber caused a significant phase advance. When cornstarch in AIN-93M was substituted with glucose, sucrose, fructose, polydextrose, high-amylose cornstarch, or gelatinized cornstarch, the amplitude of phase advance paralleled the increase in blood glucose concentration. CONCLUSIONS: Our results strongly suggest the following: (1) balanced diets containing carbohydrates/sugars and proteins are good for restricted feeding-induced entrainment of the peripheral circadian clock and (2) a balanced diet that increases blood glucose, but not by sugar alone, is suitable for entrainment. These findings may assist in the development of dietary recommendations for on-board meals served to air travelers and shift workers to reduce jet lag-like symptoms.

The Caenorhabditis elegans heterochronic gene lin-28 regulates developmental timing in the nematode trunk. We report the dynamic expression patterns of Lin-28 homologues in mouse and chick embryos. Whole mount in situ hybridization revealed specific and intriguing expression patterns of Lin-28 in the developing mouse and chick limb bud. Mouse Lin-28 expression was detected in both the forelimb and hindlimb at E9.5, but disappeared from the forelimb at E10.5, and finally from the forelimb, and hindlimb at E11.5. Chicken Lin-28, which was first detected in the limb primordium at stage 15/16, was also downregulated as the stage proceeded. The amino acid sequences of mouse and chicken Lin-28 genes are highly conserved and the similar expression patterns of Lin-28 during limb development in mouse and chicken suggest that this heterochronic gene is also conserved during vertebrate limb development. (c) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

　本研究は，肝細胞成長因子/分散因子（Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor：HGF/SF）が筋前駆細胞の走化性誘引物質かという問題と発生生物学の大きな命題である細胞の「移動」と「接着」の観点から，筋原細胞，特に初期体節由来筋前駆細胞の移動と接着に対するHGF/SFの役割について，ニワトリ３日胚体節組織培養や，タイムラプスビデオ撮影，ホールマウント免疫染色，HGF/SFビーズ移植などを通じて，in vitroおよび in vivoの両方の視点から考察することを目的としたものである。　無処理対照の肢芽部位培養体節腹唇に由来する移動最前縁部の細胞は，紡錘形を呈する筋様細胞と，線維芽細胞様もしくは上皮細胞様の扁平な形状の細胞の混在が認められたが，終濃度10ng/mlでHGF/SF処理をすると，この前縁部の細胞はほとんど紡錘形の筋原細胞となった。これらは，抗デスミン抗体や，抗Myf-5抗体，抗N-カドヘリン抗体を用いた免疫染色の結果から，筋前駆細胞，筋原細胞であることが明らかとなった。タイムラプス映像から, HGF/SFの作用によって，筋前駆細胞の運動性と増殖が顕著に促進されていることが明らかとなり，その運動はラッフリング，葉状仮足の形成と細胞極性をともなう進行方向への細胞伸展という特徴を持つことが分かった。　また，HGF/SFによって筋前駆細胞は分散・移動を亢進されるが，N-カドヘリンを細胞表面，細胞接着面に小斑状に発現し，筋管細胞への融合，分化が抑えられ，移動，接着，解離を絶え間なく繰り返すうちに増殖期に入った。このHGF/SF処理による移動性の亢進，増殖は，抗HGF/SF抗体によって顕著に抑制され，その結果としてN-カドヘリンの細胞間接着面への局在化，Myf-5の核への蓄積を伴う筋芽細胞，筋管細胞への分化が生じた。またこの培養系において，内在性のHGF/SFをあらかじめ無効にする抗HGF/SF抗体で処理すると，筋系譜への移行に障害が生じたと思われる細胞接着が強固な上皮様細胞群が出現した。　これらの結果から，HGF/SFは，上皮様の接着・特性を持つ移動筋前駆細胞が筋系譜へと移行する上皮-間充識転換の局面に何らかの形で関与しており，胚体内の腹唇においては既に筋前駆細胞として発生運命が決定されていると思われるこれら細胞のカドヘリンを介した接着を解くことで，遊走可能な間葉細胞（筋前駆細胞）にし，筋決定をより確実なものにする役割を担っていることが示唆された。さらに，in vitroにおける体節や肢芽の組織培養とその近傍へのHGF/SFビーズ静置実験, および in vivoでの胚体内へのHGF/SFビーズ移植実験などの結果は，HGF/SFが体節筋前駆細胞に対して走化性誘引物質として働いている可能性をより強めるものとなった。

　脊椎動物の骨格筋は体節に由来する。しかし，体節の筋前駆細胞の発生と分化がどのような機構により制御されているかについては，詳細は不明である。我々はニワトリ初期胚より採取した体節の培養系というこれまでほとんど試みられたことのない実験系を用いて，そこに存在する筋前駆細胞の発生について，その増殖と分化，さらにその移動において重要な役割を果たしていると考えられている肝細胞成長因子/分散因子（HGF/SF）の作用に注目して調べた。　我々は先ず体節の筋前駆細胞群の分散がHGF/SFにより著しく促進されることをビデオ撮影/タイムラプス法等で確認した。すなわち，体節辺縁から遊出した細胞群中の筋前駆細胞は，HGF/SFの作用を受けるとその運動性がきわめて高められることが示された。また，培養細胞と全胚におけるHGF/SFとその受容体であるC-METの発現について免疫染色した結果から，HGF/SFの作用にはオートクライン/パラクライン機構が関与していることが示唆された。さらに，筋特異タンパク質やPCNAの免疫染色の結果から，筋前駆細胞はHGF/SFにより増殖が促進され，分化が抑制されるらしいことも示唆された。カドヘリンの免疫染色の結果から筋前駆細胞間の接着が緩められることも確認された。また，このようなHGF/SFにより培養体節組織中の筋前駆細胞の分散・移動が亢進されることを確認する中で，これら分散した筋前駆細胞群の中には，その挙動，形態的な特徴などから，HGF/SFに対して強い走化性を示す細胞集団が存在することが強く示唆された。in vitro で筋前駆細胞の走化性が示唆されたのは本研究が初めてであり，古くから大きな関心を持たれてきた筋原細胞の移動の機構の解析において，我々の‘初期胚体節培養系’はきわめて有望なものであると思われる。　現在我々は細胞移動の程度の定量化と低濃度のHGF/SFを結合させたビーズを用いての培養系においてHGF/SFのシグナルに濃度勾配を形成させることなどを試みており，静置した体節組織から分散，遊走してくる筋前駆細胞の移動におけるHGF/SF走化性を再確認する結果を得ている。

　骨格筋筋原細胞はその分化過程において、コミットメントに伴って融合能を獲得するが、その分子機構にはいくつかの可能性が考えられる。本研究は、コミットメント過程において細胞融合に直接関与する細胞膜分子の新生が起こる可能性について検討を加えようとしたものである。これまでに融合能を持つ筋原細胞に特異的な細胞膜タンパク質の同定を試みた研究がいくつかあるが、それらは筋原細胞あるいは細胞融合に特異的なものではなく、おそらくは融合の前過程としての細胞接着に関与する分子に対するものであると思われた。　先ず、ニワトリ胚初代培養筋芽細胞の融合開始期および融合期にあるものについて、その全細胞あるいは粗細胞膜分画をウサギに抗原として投与し、得られた抗血清についてそれらの融合阻止作用を調べ、阻止作用を示すものについて増殖期の細胞あるいは細胞膜分画で吸収することにより、融合を阻止する抗体を含む抗血清標品を得ることを試みた。しかしながら、得られた粗血清がすべて細胞の増殖と分化を著しく阻害することが示され、またその阻害作用は吸収後のものについても示された。何度かにわたる試みにもかかわらず、現在までのところ期待した結果は得られていないが、今後戦略および方法のさらなる検討を行いたいと思っている。　ところで、本研究課題遂行の過程で、生理活性物質、抗体等の作用の検討における無血清培養系の確立の必要性が痛感されたため、これまで初代培養筋芽細胞・衛星細胞、株細胞等の筋前駆細胞の培養で報告されていた無血清培養液と我々の経験をもとにニワトリ胚初代培養筋芽細胞に適した無血清培養液の開発を試みた。その結果、ダルベッコ改変イーグルMEMにウシインスリン、ニワトリトランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト線維芽細胞成長因子－２を加えたものが、筋芽細胞の増殖とそれに続く分化を実現するのに極めて有効であることが判明した（Zool.Sci.17:201-207(2000)）。この培養液は今後の筋発生研究にとって価値あるものとなると考えられる。

　本研究は、筋分化制御因子としてのアクチビン/フォリスタチンの役割について考察することを目的としている。97年度において、発生段階の異なる筋芽細胞のアクチビンに対する応答性の相違に焦点を合わせ、孵卵3.5～15日目のニワトリ胚の筋芽細胞および孵化後3日目の幼鶏の胸筋由来の衛星細胞の初代培養系を用いて、形態学的、免疫化学的、生化学的に発生段階依存的な感受性の変動について調べた結果、アクチビンの筋分化抑制作用については、進んだ発生段階の細胞ほどその感受性が低くなることが示唆された。今年度においては、発生段階がより初期のものについてアクチビン/フォリスタチン系の役割に調べるため、これまで明確な報告がない培養初期体節から遊出してくる筋原細胞による筋発生について調べた。　先ず、その培養系を確立するため、材料とする胚の胚齢、培養液等の培養条件の検討を行った。その結果、胚齢3.5日のものが適当であること、培養条件としては80%DMEM-20%FBS-30ug/ml ニワトリトランスフェリンの増殖培養液中で24時間培養した後に、98%DMEM-2%FBS-30ug/ml ニワトリトランスフェリンの分化培養液に転換するのが適当であることが判明した。この系で調べた結果、体節由来の筋原細胞による筋の発生・分化はアクチビンＡによって著しく抑制されること、その感受性は3.5日胚の胸筋由来の筋芽細胞よりもさらに高いことが示された。このことは、アクチビンが筋細胞分化において重要な役割を果たしていることを示唆していると考えられる。　また、フォリスタチンの筋発生促進作用についても、発生段階が初期の細胞ほど高い感受性を示し、体節由来筋原細胞は著しく高い感受性を示すことが示された。

本研究では、筋分化制御因子としてのアクチビンの役割について考察するため、発生段階の異なる筋芽細胞のアクチビンに対する応答性の相違に焦点を合わせ、孵卵3.5、9、11、15日目のニワトリ胚（E3.5、E9、E11、E15）の筋芽細胞および孵化後3日目の幼鶏（PH3）の胸筋由来の衛星細胞の初代培養系を用いて、形態学的、免疫化学的、生化学的に発生段階依存的な感受性の変動について調べた。また、発生の初期から異なる細胞系譜をたどることが知られている胸筋と後肢大腿筋の筋芽細胞についても、アクチビンに対する感受性を調べ比較した。さらに、比較検討のため他の筋分化制御因子についても同様に調べた。　その結果、アクチビンの筋分化抑制作用については、進んだ発生段階の細胞ほど、その感受性が低くなることが示唆された。特に、E3.5体節由来の筋芽細胞は著しく高い感受性を示した。また、同じ発生段階由来の筋芽細胞では、大腿筋よりも胸筋の方がアクチビンに対する感受性が高いことが示唆された。また、その結果は胸筋由来の筋芽細胞よりも大腿筋由来の筋芽細胞の方が、発生段階依存的な変化が先行している可能性を示唆するものであった。これらの結果はアクチビンが筋発生、特にその初期過程において重要な役割を果たしていることを推察させた。　FGFについては、進んだ発生段階の筋芽細胞ほど分化が抑制されることが示され、FGFの作用に対して強い感受性を示す細胞ほど、分裂周期から抜け出すことができず、分化相へのコミットメントが遅れ、結果として筋分化が抑えられることが確認された。　トランスフェリン（Tf）については、胸筋由来の筋芽細胞ではE9からE15のもので、大腿筋由来の筋芽細胞ではE9からE11のもので、発生段階が進むにつれて感受性は高くなることが確認され、また発生初期段階の筋芽細胞においては外因性のTfの存在は生存・増殖・分化に必須であるが、PH3胸筋衛星細胞およびE15大腿筋筋芽細胞では、Tfを与えなくてもかなりの筋管が形成されることが示された。