HER2 is overexpressed in 25–30% of breast cancers, and approximately 30% of HER2-positive breast cancers metastasize to the brain. Although the incidence of brain metastasis in HER2-positive breast cancer is high, previous studies have been mainly based on cell lines of the triple-negative subtype, and the molecular mechanisms of brain metastasis in HER2-positive breast cancer are unclear. In the present study, we performed intracranial injection using nine HER2-positive breast cancer cell lines to evaluate their proliferative activity in brain tissue. Our results show that UACC-893 and MDA-MB-453 cells rapidly proliferated in the brain parenchyma, while the other seven cell lines moderately or slowly proliferated. Among these nine cell lines, the proliferative activity in brain tissue was not correlated with either the HER2 level or the HER2 phosphorylation status. To extract signature genes associated with brain colonization, we conducted microarray analysis and found that these two cell lines shared 138 gene expression patterns. Moreover, some of these genes were correlated with poor prognosis in HER2-positive breast cancer patients. Our findings might be helpful for further studying brain metastasis in HER2-positive breast cancer.

Sonic hedgehog (SHH) is important for organogenesis during development. Recent studies have indicated that SHH is also involved in the proliferation and transformation of astrocytes to the reactive phenotype. However, the mechanisms underlying these are unknown. Involvement of SHH signaling in calcium (Ca) signaling has not been extensively studied. Here, we report that SHH and Smoothened agonist (SAG), an activator of the signaling receptor Smoothened (SMO) in the SHH pathway, activate Ca oscillations in cultured murine hippocampal astrocytes. The response was rapid, on a minute time scale, indicating a noncanonical pathway activity. Pertussis toxin blocked the SAG effect, indicating an involvement of a G(i) coupled to SMO. Depletion of extracellular ATP by apyrase, an ATP-degrading enzyme, inhibited the SAG-mediated activation of Ca oscillations. These results indicate that SAG increases extracellular ATP levels by activating ATP release from astrocytes, resulting in Ca oscillation activation. We hypothesize that SHH activates SMO-coupled Gi in astrocytes, causing ATP release and activation of G(q/11)-coupled P2 receptors on the same cell or surrounding astrocytes. Transcription factor activities are often modulated by Ca patterns; therefore, SHH signaling may trigger changes in astrocytes by activating Ca oscillations. This enhancement of Ca oscillations by SHH signaling may occur in astrocytes in the brain in vivo because we also observed it in hippocampal brain slices. In summary, SHH and SAG enhance Ca oscillations in hippocampal astrocytes, G(i) mediates SAG-induced Ca oscillations downstream of SMO, and ATP-permeable channels may promote the ATP release that activates Ca oscillations in astrocytes.

本研究では、脱髄時に髄鞘の崩壊により脳内の細胞へコレステロールが蓄積するという仮説を検証するため、実験系の構築を試みた。コレステロールは細胞膜に豊富に含まれることから、脱髄時のコレステロール増加は細胞膜で起きると考え、細胞膜コレステロール量の定量を目指した。細胞膜コレステロールを可視化するセンサータンパク質を精製し動作確認を行なった結果、培養細胞へコレステロール刺激をした際に3-5倍に増加することを確認できた。今後は本センサータンパク質を用いて、脱髄時の脳サンプルでコレステロール量の定量をおこなっていくことを計画している。

本研究では、アストロサイトが高コレステロール環境下で細胞死を回避する機構の解明をカルシウム振動依存性という観点から行なった。これまでに、コレステロール刺激によりアストロサイトで変動する遺伝子群が判明していることから、これらのうちカルシウム振動依存的に増減を示す遺伝子の特定を目標とした。本年は、リアルタイムPCRにより変動を示す遺伝子群の解析と、その後に続く遺伝子発現抑制実験のための発現プラスミド作成に着手した。実験系が確立されたことから、今後は実際にカルシウム振動の有無により変動に差が現れる遺伝子群の特定と、それらの因子が細胞生存に与える影響の評価を予定している。

　本研究では、コレステロールが中枢神経系に存在する細胞腫の１種であるアストロサイトで顕著なカルシウム振動を誘導するという現象に対して、その応答メカニズムの検討を行なった。まず、コレステロール誘導性カルシウム振動は細胞外にコレステロールが存在するという事象ではなく、細胞膜中のコレステロール量が増加することで引き起こされることを明らかにした。次に、このカルシウム振動は細胞外からのカルシウム流入ではなく小胞体からのカルシウム流出入によって構成されることを見出した。これらの研究成果について、国内学会にて1件の発表を行なった。