2022/12/04 更新

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コイデ タカキ
小出 隆規
Scopus 論文情報  
論文数: 0  Citation: 0  h-index: 9

Citation Countは当該年に発表した論文の被引用数

所属
理工学術院 先進理工学部
職名
教授

他学部・他研究科等兼任情報

  • 理工学術院   大学院先進理工学研究科

学内研究所・附属機関兼任歴

  • 2020年
    -
    2022年

    理工学術院総合研究所   兼任研究員

学歴

  •  
    -
    1994年

    京都大学   薬学研究科 博士課程  

  •  
    -
    1991年

    京都大学   薬学研究科 修士課程  

  •  
    -
    1989年

    京都大学   薬学部  

学位

  • 京都大学   博士(薬学)

経歴

  • 2007年
    -
    継続中

    早稲田大学   理工学術院 先進理工学部 化学・生命化学科   教授

  • 2006年
    -
     

    新潟薬科大学   薬学部   教授

  • 2003年
    -
     

    新潟薬科大学   薬学部   助教授

  • 2000年
    -
     

    徳島大学   工学部 生物工学科   講師

  • 1999年
    -
     

    徳島大学   工学部 生物工学科   助手

  • 1996年
    -
     

    京都大学再生医科学研究所細胞機能調節学分野

  • 1995年
    -
     

    Joslin Diabetes Center / Harvard Medical School

  • 1994年
    -
     

    持田製薬株式会社

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所属学協会

  •  
     
     

    American Society for Biochemistry and Molecular Biology (ASBMB)

  •  
     
     

    フロンティア生命化学研究会

  •  
     
     

    日本ケミカルバイオロジー学会

  •  
     
     

    日本化学会

  •  
     
     

    日本細胞生物学会

  •  
     
     

    日本分子生物学会

  •  
     
     

    日本薬学会

  •  
     
     

    日本生化学会

  •  
     
     

    日本ペプチド学会

  •  
     
     

    日本結合組織学会

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研究分野

  • 構造生物化学

  • 生物分子化学

  • 薬系化学、創薬科学

研究キーワード

  • タンパク質、ペプチド、コラーゲン、細胞外マトリックス、創薬

論文

  • 変性コラーゲンとハイブリッド形成するペプチドを用いた新たなDDSの可能性

    金井沙也伽, 小出隆規

      35 ( 3 ) 181 - 190  2020年07月

    担当区分:最終著者, 責任著者

    DOI

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  • Spatiotemporal regulation of PEDF signaling by type I collagen remodeling.

    Kazuki Kawahara, Takuya Yoshida, Takahiro Maruno, Hiroya Oki, Tadayasu Ohkubo, Takaki Koide, Yuji Kobayashi

    Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America   117 ( 21 ) 11450 - 11458  2020年05月  [査読有り]  [国際誌]

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    Dynamic remodeling of the extracellular matrix affects many cellular processes, either directly or indirectly, through the regulation of soluble ligands; however, the mechanistic details of this process remain largely unknown. Here we propose that type I collagen remodeling regulates the receptor-binding activity of pigment epithelium-derived factor (PEDF), a widely expressed secreted glycoprotein that has multiple important biological functions in tissue and organ homeostasis. We determined the crystal structure of PEDF in complex with a disulfide cross-linked heterotrimeric collagen peptide, in which the α(I) chain segments-each containing the respective PEDF-binding region (residues 930 to 938)-are assembled with an α2α1α1 staggered configuration. The complex structure revealed that PEDF specifically interacts with a unique amphiphilic sequence, KGHRGFSGL, of the type I collagen α1 chain, with its proposed receptor-binding sites buried extensively. Molecular docking demonstrated that the PEDF-binding surface of type I collagen contains the cross-link-susceptible Lys930 residue of the α1 chain and provides a good foothold for stable docking with the α1(I) N-telopeptide of an adjacent triple helix in the fibril. Therefore, the binding surface is completely inaccessible if intermolecular crosslinking between two crosslink-susceptible lysyl residues, Lys9 in the N-telopeptide and Lys930, is present. These structural analyses demonstrate that PEDF molecules, once sequestered around newly synthesized pericellular collagen fibrils, are gradually liberated as collagen crosslinking increases, making them accessible for interaction with their target cell surface receptors in a spatiotemporally regulated manner.

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    7
    被引用数
    (Scopus)
  • Peptide precursors that acquire denatured collagen-hybridizing ability by O-to-N acyl migration at physiological pH

    Sayaka Kanai, Koshi Machida, Ryo Masuda, Takaki Koide

    Organic & Biomolecular Chemistry   18 ( 15 ) 2823 - 2827  2020年  [査読有り]  [国際誌]

    担当区分:責任著者

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    <p>Collagen-like peptides containing Gly-Ser <italic>O</italic>-acyl isopeptide units without self-assembling propensity serve as precursors for collagen-detecting agents.</p>

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    3
    被引用数
    (Scopus)
  • Lowering the culture temperature corrects collagen abnormalities caused by HSP47 gene knockout.

    Kazunori K Fujii, Yuki Taga, Takayuki Sakai, Shinya Ito, Shunji Hattori, Kazuhiro Nagata, Takaki Koide

    Scientific reports   9 ( 1 ) 17433 - 17433  2019年11月  [査読有り]  [国際誌]

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    Heat shock protein 47 (HSP47) is an endoplasmic reticulum (ER)-resident molecular chaperone that specifically recognizes triple helical portions of procollagens. The chaperone function of HSP47 is indispensable in mammals, and hsp47-null mice show an embryonic lethal phenotype accompanied by severe abnormalities in collagen-based tissue structures. Two leading hypotheses are currently accepted for the molecular function of HSP47 as a procollagen-specific chaperone. One is facilitation of procollagen folding by stabilizing thermally unstable triple helical folding intermediates, and the other is inhibition of procollagen aggregation or lateral association in the ER. The aim of this study was to elucidate the functional essence of this unique chaperone using fibroblasts established from hsp47-/- mouse embryos. When the cells were cultured at 37 °C, various defects in procollagen biosynthesis were observed, such as accumulation in the ER, over-modifications including prolyl hydroxylation, lysyl hydroxylation, and further glycosylation, and unusual secretion of type I collagen homotrimer. All defects were corrected by culturing the cells at a lower temperature of 33 °C. These results indicated that lowering the culture temperature compensated for the loss of HSP47. This study elucidated that HSP47 stabilizes the elongating triple helix of procollagens, which is otherwise unstable at the body temperature of mammals.

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    10
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    (Scopus)
  • Development of a collagen-like peptide polymer via end-to-end disulfide cross-linking and its application as a biomaterial.

    Shinichiro F Ichise, Shungo Takeuchi, Shigehisa Aoki, Kazuki C Kuroda, Hiroshi Nose, Ryo Masuda, Takaki Koide

    Acta biomaterialia   94   361 - 371  2019年08月  [査読有り]  [国際誌]

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    Collagen is the most abundant protein in the animal kingdom and has a unique triple-helical structure. It not only provides mechanical strength to tissues, but also performs specific biological functions as a multifaceted signaling molecule. Animal-derived collagen is therefore widely used as a biocompatible material in vitro and in vivo. In this study, we developed a novel peptide-based material that mimicked both the polymeric properties and a selected biological function of native collagen. This material was prepared by end-to-end multiple disulfide cross-linking of chemically synthesized triple-helical peptides. The peptide polymer showed a gel-forming property, and receptor-specific cell binding was observed in vitro by incorporating a peptide harboring an integrin α2β1-binding sequence. Furthermore, cell signaling activity and biodegradability were tunable according to the polymer contents. The results demonstrated the potential of this material as a designer collagen. STATEMENT OF SIGNIFICANCE: Collagen is a useful biomaterial with the gel-forming property. It also exhibits various biological activities through the interaction of specific amino acid sequences displayed on the triple helix with functional biomacromolecules. Here we report a novel synthetic material, artificial collagen, by end-to-end cross-linking of chemically synthesized collagen-like triple-helical peptides. The material allows independent regulation of polymer properties, i.e. gel stiffness, and sequence-specific bioactivities by altering peptide compositions. This material can also be variously shaped, for example, thin films with high transparency. In addition, it has low inflamatogenic properties and tunable biodegradability in vivo.

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    7
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    (Scopus)
  • Structural optimization of cyclic peptides that efficiently detect denatured collagen.

    Koh K. Takita, Kazunori K. Fujii, Kento Ishii, Takaki Koide

    Organic & Biomolecular Chemistry   7 ( 17 ) 7380 - 7387  2019年  [査読有り]

    DOI

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    7
    被引用数
    (Scopus)
  • A Strategy for Discovering Heterochiral Bioactive Peptides by Using the OB2nP Library and SPOTs Method.

    Hinako Udagawa, Takato H. Yoneda, Ryo Masuda, Takaki Koide

    ChemBioChem   20 ( 16 ) 2070 - 2073  2019年  [査読有り]

    担当区分:最終著者, 責任著者

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    2
    被引用数
    (Scopus)
  • Cyclic Peptides for Efficient Detection of Collagen

    Koh K. Takita, Kazunori K. Fujii, Tetsuya Kadonosono, Ryo Masuda, Takaki Koide

    ChemBioChem   19 ( 15 ) 1613 - 1617  2018年08月  [査読有り]

    担当区分:責任著者

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    © 2018 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim We report here a new class of collagen-binding peptides, cyclic collagen-mimetic peptides (cCMPs), that efficiently hybridize with the triple-helix-forming portions of collagen. cCMPs are composed of two parallel collagen-like (Xaa-Yaa-Gly)n strands with both termini tethered by covalent linkages. Enzyme-linked immunosorbent assays and western blotting analysis showed that cCMPs exhibit more potent affinity toward collagen than reported collagen-binding peptides and can specifically detect different collagen polypeptides in a mixture of proteins. Collagen secreted from cultured cells was detected by confocal microscopy with fluorescein-labeled cCMP. The cCMP is also shown to detect sensitively folding intermediates in the endoplasmic reticulum, something that was difficult to visualize with conventional collagen detectors. Molecular-dynamics simulations suggested that a cCMP forms a more stably hybridized product than its single-chain counterpart; this could explain why cCMP has higher affinity toward denatured collagen. These results indicate the usefulness of cCMPs as tools for detecting denatured collagen.

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    11
    被引用数
    (Scopus)
  • Development of a carboplatin derivative conjugated with a collagen-like triple-helical peptide

    Ryo Masuda, Risa Hayashi, Hiroshi Nose, Akihiro Taguchi, Yoshio Hayashi, Hiroyuki Yasui, Takaki Koide

    Future Medicinal Chemistry   10 ( 6 ) 619 - 629  2018年03月  [査読有り]

    担当区分:最終著者, 責任著者

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    Aim: The development of a platinum anticancer agent that has improved efficacy by efficient delivery to a tumor and that suppresses side effects has been investigated. Arginine-rich triple-helical peptides are promising drug carriers because of their stability in body fluids and cell-penetrating activity. Results: We synthesized a carboplatin derivative conjugated with an arginine-rich triple-helical peptide. This derivative released platinum under acidic conditions or in the presence Cl- ions. Administration of this derivative to P388 tumor-bearing mice showed comparable survival rates to twice the dose of carboplatin, which was attributed to a longer mean residence time by pharmacokinetics analysis. Conclusion: The collagen-like triple-helical peptide was an efficient carrier of a platinum anticancer agent because of a modification to its pharmacokinetic profile.

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    5
    被引用数
    (Scopus)
  • Expression of Collagenase is Regulated by the VarS/VarA Two-Component Regulatory System in Vibrio alginolyticus.

    Takehiko Mima, Kazuyoshi Gotoh, Yumiko Yamamoto, Keiko Maeda, Taku Shirakawa, Shunsuke Matsui, Yumi Murata, Takaki Koide, Hiroshi Tokumitsu, Osamu Matsushita

    The Journal of membrane biology   251 ( 1 ) 51 - 63  2018年02月  [査読有り]  [国際誌]

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    Vibrio alginolyticus is an opportunistic pathogen in both humans and marine animals. Collagenase encoded by colA is considered to be one of the virulence factors. Expression of colA is regulated by multiple environmental factors, e.g., temperature, growth phase, and substrate. To elucidate the mechanism of regulation of colA expression, transposon mutagenesis was performed. VarS, a sensor histidine kinase of the two-component regulatory system, was demonstrated to regulate the expression of colA. VarA, a cognate response regulator of VarS, was also identified and shown to be involved in the regulation of colA expression. In vitro phosphorylation assays showed that phosphorylated VarS acted as a phosphoryl group donor to VarA. A site-directed mutagenesis study showed that the His300, Asp718 and His874 residues in VarS were essential for the phosphorylation of VarS, and the Asp54 residue in VarA was likely to receive the phosphoryl group from VarS. The results demonstrate that the VarS/VarA two-component regulatory system regulates the expression of collagenase in V. alginolyticus.

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    4
    被引用数
    (Scopus)
  • 人工コラーゲンの開発とバイオマテリアルとしての応用可能性

    市瀬慎一郎, 小出隆規

    BIO INDUSTRY   35 ( 10 ) 1 - 8  2018年  [招待有り]

  • Basic Fibroblast Growth Factor Fused with Tandem Collagen-Binding Domains from Clostridium histolyticum Collagenase ColG Increases Bone Formation

    Hiroyuki Sekiguchi, Kentaro Uchida, Osamu Matsushita, Gen Inoue, Nozomu Nishi, Ryo Masuda, Nana Hamamoto, Takaki Koide, Shintaro Shoji, Masashi Takaso

    BioMed Research International   2018   8393194  2018年  [査読有り]

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    Basic fibroblast growth factor 2 (bFGF) accelerates bone formation during fracture healing. Because the efficacy of bFGF decreases rapidly following its diffusion from fracture sites, however, repeated dosing is required to ensure a sustained therapeutic effect. We previously developed a fusion protein comprising bFGF, a polycystic kidney disease domain (PKD
    s2b), and collagen-binding domain (CBD
    s3) sourced from the Clostridium histolyticum class II collagenase, ColH, and reported that the combination of this fusion protein with a collagen-like peptide, poly(Pro-Hyp-Gly)10, induced mesenchymal cell proliferation and callus formation at fracture sites. In addition, C. histolyticum produces class I collagenase (ColG) with tandem CBDs (s3a and s3b) at the C-terminus. We therefore hypothesized that a bFGF fusion protein containing ColG-derived tandem CBDs (s3a and s3b) would show enhanced collagen-binding activity, leading to improved bone formation. Here, we examined the binding affinity of four collagen anchors derived from the two clostridial collagenases to H-Gly-Pro-Arg-Gly-(Pro-Hyp-Gly)12-NH2, a collagenous peptide, by surface plasmon resonance and found that tandem CBDs (s3a-s3b) have the highest affinity for the collagenous peptide. We also constructed four fusion proteins consisting of bFGF and s3 (bFGF-s3), s2b-s3b (bFGF-s2b-s3), s3b (bFGF-s3b), and s3a-s3b (bFGF-s3a-s3b) and compared their biological activities to those of a previous fusion construct (bFGF-s2b-s3) using a cell proliferation assay in vitro and a mouse femoral fracture model in vivo. Among these CB-bFGFs, bFGF-s3a-s3b showed the highest capacity to induce mesenchymal cell proliferation and callus formation in the mice fracture model. The poly(Pro-Hyp-Gly)10/bFGF-s3a-s3b construct may therefore have the potential to promote bone formation in clinical settings.

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    12
    被引用数
    (Scopus)
  • Structure–activity relationships and action mechanisms of collagen-like antimicrobial peptides

    R. Masuda, Y. Dazai, T. Miwa, T. Koide

    BIOPOLYMERS   108 ( 1 ) e22931  2017年01月  [査読有り]

    DOI

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    5
    被引用数
    (Scopus)
  • Collagen-Like Antimicrobial Peptides

    Ryo Masuda, Masakazu Kudo, Yui Dazai, Takehiko Mima, Takaki Koide

    BIOPOLYMERS   106 ( 4 ) 453 - 459  2016年07月  [査読有り]

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    Combinatorial library composed of rigid rod-like peptides with a triple-helical scaffold was constructed. The component peptides were designed to have various combinations of basic and neutral (or hydrophobic) amino acid residues based on collagen-like (Gly-Pro-Yaa)-repeating sequences, inspired from the basic and amphiphilic nature of naturally occurring antimicrobial peptides. Screening of the peptide pools resulted in identification of antimicrobial peptides. A structure-activity relationship study revealed that the position of Arg-cluster at N-terminus and cystine knots at C-terminus in the triple helix significantly contributed to the antimicrobial activity. The most potent peptide RO-A showed activity against Gram-negative Escherichia coli and Gram-positive Bacillus subtilis. In addition, Escherichia coli exposed to RO-A resulted in abnormal elongation of the cells. RO-A was also shown to have remarkable stability in human serum and low cytotoxicity to mammalian cells. (C) 2016 Wiley Periodicals, Inc.

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    5
    被引用数
    (Scopus)
  • Cellular uptake of IgG using collagen-like cell-penetrating peptides

    Ryo Masuda, Kazuhiro Yamamoto, Takaki Koide

    Biological and Pharmaceutical Bulletin   39 ( 1 ) 130 - 134  2016年01月  [査読有り]

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    Cell-penetrating peptides (CPPs) are attractive tools for delivering macromolecules that have poor membrane permeability, such as antibodies, into cells. However, the major drawback of conventional CPPs is their instability in bodily fluids. We previously reported a novel CPP employing a collagen-like triple-helical structure that exhibited remarkable resistance against serum proteases. Herein, we report the delivery of full-length immunoglobulin G (IgG) antibody into cells using a triple-helical CPP. The CPP was conjugated to IgG via a one-pot reaction using 2-iminothiolane as a crosslinking reagent. The triple-helical CPP was less prone to being aggregated and neutralized by serum than was octaarginine, a conventional CPP. However, most of the conjugates were found to be entrapped in endosomes.

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    5
    被引用数
    (Scopus)
  • Fecal excretion of orally administered collagen-like peptides in rats: Contribution of the triple-helical conformation to their stability

    Takaki Koide, Naoyuki Yamamoto, Kazuma B. Taira, Hiroyuki Yasui

    Biological and Pharmaceutical Bulletin   39 ( 1 ) 135 - 137  2016年01月  [査読有り]

    担当区分:筆頭著者, 責任著者

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    Orally ingested peptides are generally digested in the gastrointestinal (GI) tract and absorbed in the form of oligopeptides. We previously reported that intravenously administered collagen-like triple-helical peptides circulated in the bloodstream and were excreted in their intact forms in urine nearly quantitatively. In the present study, we investigated the fates of orally administered collagen-like peptides in rats. (Pro-Hyp-Gly)10 (Hyp: 4-hydroxyproline), which formed a stable triple-helical structure, was stable in the GI tract, and 72.3±13.0% of the peptide was excreted in the feces. Its recovery ratio was similar to that of all-D-(Pro-Pro-Gly)10 (75.1±15.7%), the indigestible control. In contrast, (Pro-Hyp-Gly)5 and (Pro-Pro-Gly)10, the random coil conformations of which were dominant at body temperature, were not detected in fecal samples, indicating that they were digested by proteases. The high stability of the triple-helical conformation in mammalian bodies suggests the potential use of collagen-like peptides as novel scaffolds of peptide drugs.

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    10
    被引用数
    (Scopus)
  • A Cisplatin Derivative that Inhibits Collagen Fibril-Formation in vitro

    Miyu Zenda, Hiroyuki Yasui, Shinya Oishi, Ryo Masuda, Nobutaka Fujii, Takaki Koide

    CHEMICAL BIOLOGY & DRUG DESIGN   85 ( 5 ) 519 - 526  2015年05月  [査読有り]

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    Using an in vitro random screening of small-molecule compounds, we discovered cis-diamminedichloroplatinum(II) (cisplatin), an anticancer agent, as a potential inhibitor of collagen fibril-formation. The inhibitory effect was found only when cisplatin was dissolved in dimethylsulphoxide (DMSO), indicating that the active species were cisplatin derivatives formed in the DMSO solution. The cisplatin derivatives inhibited the formation of collagen fibrils in vitro without affecting the triple-helical conformation of the collagen molecules. Incubation with the cisplatin solution in DMSO also inhibited in situ deposition of collagen fibrils in a human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) culture. In addition, the derivatization of cisplatin in DMSO abolished the cytotoxicity of the original compound. The platinum complex was further revealed to interact with specific sites on the collagen triple helix, and the binding sites were suggested to contain His and/or Met residues. Mass spectrometry analysis of the cisplatin solution in DMSO and a structure-activity relationship study strongly suggested that the active compound is [Pt(NH3)(2)(Cl)(DMSO)](+). This platinum complex will be useful for investigating molecular mechanisms of collagen self-assembly and for drug development for the treatment of fibrotic diseases.

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    7
    被引用数
    (Scopus)
  • コラーゲン3重らせんペプチドの応用:体内動態特性と薬物担体としての可能性

    安井裕之, 小出隆規

    遺伝子医学MOOK 別冊「次世代ペプチド医薬創製」     98 - 106  2014年  [招待有り]

  • 3重らせんペプチドの医薬分野への応用可能性

    小出隆規

    Medchem News   24   25 - 25  2014年  [招待有り]

  • コラーゲン3重らせんを模倣するペプチドの創薬及びバイオマテリアルへの応用

    小出 隆規

    薬学雑誌. 乙号   133 ( 3 ) 387 - 392  2013年

    DOI

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    2
    被引用数
    (Scopus)
  • コラーゲン様ペプチド超分子

    市瀬慎一郎, 小出隆樹

    コラーゲンの製造と応用展開II     105 - 113  2013年

  • Collagen-like Cell-Penetrating Peptides

    Chisato M. Yamazaki, Ikuhiko Nakase, Hiroyuki Endo, Saya Kishimoto, Yoshihiro Mashiyama, Ryo Masuda, Shiroh Futaki, Takaki Koide

    ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION   52 ( 21 ) 5497 - 5500  2013年  [査読有り]

    DOI

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    36
    被引用数
    (Scopus)
  • Potential of collagen-like triple helical peptides as drug carriers: Their in vivo distribution, metabolism, and excretion profiles in rodents

    Hiroyuki Yasui, Chisato M. Yamazaki, Hiroshi Nose, Chihiro Awada, Toshifumi Takao, Takaki Koide

    Biopolymers   100 ( 6 ) 705 - 713  2013年

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    Collagen-model peptides composed of (X-Y-Gly)n sequences were used to study the triple helical structure of collagen. We report the stability of these collagen-like peptides in biological fluids, and their pharmacokinetics including distribution, metabolism, and excretion in animals. A typical collagen-model peptide, H-(Pro-Hyp-Gly)10-OH, was found to be extremely stable in the plasma and distributed mainly in the vascular blood space, and was eliminated through glomerular filtration in the kidneys. Triple helical peptides of (X-Y-Gly)n sequences were quantitatively recovered from the urine of rats after intravenous injection regardless of the differences in peptide net charge between -3 and +6 per triple helix. In contrast, the renal clearance became less efficient when the number of triplet repeats (n) was 12 or more. We also demonstrated the application of a collagen-like triple helical peptide as a novel drug carrier in the blood with a high urinary excretion profile. We further demonstrated that a collagen-like triple helical peptide conjugated to a spin probe, PROXYL, has the potential to evaluate the redox status of oxidative stress-induced animals in vivo. © 2013 Wiley Periodicals, Inc. Biopolymers (Pept Sci).

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    20
    被引用数
    (Scopus)
  • Bacterial collagen-binding domain targets undertwisted regions of collagen

    Sagaya Theresa Leena Philominathan, Takaki Koide, Osamu Matsushita, Joshua Sakon

    PROTEIN SCIENCE   21 ( 10 ) 1554 - 1565  2012年10月  [査読有り]

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    Clostridium histolyticum collagenase causes extensive degradation of collagen in connective tissue that results in gas gangrene. The C-terminal collagen-binding domain (CBD) of these enzymes is the minimal segment required to bind to a collagen fibril. CBD binds unidirectionally to the undertwisted C-terminus of triple helical collagen. Here, we examine whether CBD could also target undertwisted regions even in the middle of the triple helix. Collageneous peptides with an additional undertwisted region were synthesized by introducing a Gly ? Ala substitution [(POG)xPOA(POG)y]3, where x + y = 9 and x &gt; 3). 1H15N heteronuclear single quantum coherence nuclear magnetic resonance (HSQC NMR) titration studies with 15N-labeled CBD demonstrated that the minicollagen binds to a 10 angstrom wide 25 angstrom long cleft. Six collagenous peptides each labeled with a nitroxide radical were then titrated with 15N-labeled CBD. CBD binds to either the Gly ? Ala substitution site or to the C-terminus of each minicollagen. Small-angle X-ray scattering measurements revealed that CBD prefers to bind the Gly ? Ala site to the C-terminus. The HSQC NMR spectra of 15N-labeled minicollagen and minicollagen with undertwisted regions were unaffected by the titration of unlabeled CBD. The results imply that CBD binds to the undertwisted region of the minicollagen but does not actively unwind the triple helix.

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    22
    被引用数
    (Scopus)
  • NMR and Mutational Identification of the Collagen-Binding Site of the Chaperone Hsp47

    Maho Yagi-Utsumi, Sumi Yoshikawa, Yoshiki Yamaguchi, Yohei Nishi, Eiji Kurimoto, Yoshihito Ishida, Takayuki Homma, Jun Hoseki, Yoshimi Nishikawa, Takaki Koide, Kazuhiro Nagata, Koichi Kato

    PLOS ONE   7 ( 9 ) e45930  2012年09月  [査読有り]

     概要を見る

    Heat shock protein 47 (Hsp47) acts as a client-specific chaperone for collagen and plays a vital role in collagen maturation and the consequent embryonic development. In addition, this protein can be a potential target for the treatment of fibrosis. Despite its physiological and pathological importance, little is currently known about the collagen-binding mode of Hsp47 from a structural aspect. Here, we describe an NMR study that was conducted to identify the collagen-binding site of Hsp47. We used chicken Hsp47, which has higher solubility than its human counterpart, and applied a selective N-15-labeling method targeting its tryptophan and histidine residues. Spectral assignments were made based on site-directed mutagenesis of the individual residues. By inspecting the spectral changes that were observed upon interaction with a trimeric collagen peptide and the mutational data, we successfully mapped the collagen-binding site in the B/C beta-barrel domain and a nearby loop in a 3D-homology model based upon a serpin fold. This conclusion was confirmed by mutational analysis. Our findings provide a molecular basis for the design of compounds that target the interaction between Hsp47 and procollagen as therapeutics for fibrotic diseases.

    DOI

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    11
    被引用数
    (Scopus)
  • Surface-Modifiable Free-Floating Films Formed by Multiway Connection of Collagen-Like Triple-Helical Peptides

    Shunsuke Matsui, Chisato M. Yamazaki, Takaki Koide

    MACROMOLECULAR RAPID COMMUNICATIONS   33 ( 10 ) 911 - 915  2012年05月  [査読有り]

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    Square-millimeter-sized free-floating translucent films are formed in physiological buffer by multiway connections between biotinylated collagen-like triple-helical peptides and avidin. Although the compositions of the films are almost constant, regardless of the ratios of the components loaded, their thicknesses can be controlled by the concentrations of the components. The film surfaces can be further modified by taking advantage of exposed biotin (or avidin) functionalities. The self-assembled films could serve as novel materials in biomedical and biosensing applications.

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    5
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    (Scopus)
  • High-Throughput Turbidimetric Screening for Heparin-Neutralizing Agents and Low-Molecular-Weight Heparin Mimetics

    Atsushi Sekiya, Shinya Oishi, Nobutaka Fujii, Takaki Koide

    CHEMICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN   60 ( 3 ) 371 - 376  2012年03月  [査読有り]

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    Safer heparin-neutralizing agents are currently required to replace protamine, the use of which causes adverse effects such as anaphylaxia. Low-molecular-weight (LMW) heparin mimetics that potentiate antithrombin III (AT) action are also valuable as anti-thrombotics. This paper describes a high-throughput assay for both heparin-neutralizing agents and LMW heparin mimetics without the use of blood preparations. The assay is based on turbidimetric measurement of a solution of collagen, heparin, and a test compound. Native collagen molecules spontaneously form insoluble fibrils when transferred to a physiological buffer, and this process is inhibited by heparin. In the presence of a heparin-neutralizing agent or an LMW heparin mimetic, the inhibitory effect of heparin is canceled and turbidity increase is retrieved. We demonstrated that this assay is effective in detecting potential agents with high reliability (Z' factor=0.9). The screening of a chemical library (34400 compounds) was further performed in a 384-well format, and led to the identification of a novel heparin-neutralizing agent. Since this assay protocol is feasible for an automated high-throughput screening (HTS) system, it could enhance the lead seeking process for drugs related to heparin/heparan sulfate (HS) functions.

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    2
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  • コラーゲン三重らせんペプチドのデザイン、合成と応用(木曽良明編)

    小出隆規

    遺伝子医学MOOK 21「最新ペプチド合成技術とその創薬研究への応用」   21   217 - 222  2012年

  • Pigment Epithelium-derived Factor (PEDF) Shares Binding Sites in Collagen with Heparin/Heparan Sulfate Proteoglycans

    Atsushi Sekiya, Hitomi Okano-Kosugi, Chisato M. Yamazaki, Takaki Koide

    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY   286 ( 30 ) 26364 - 26374  2011年07月  [査読有り]

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    Pigment epithelium-derived factor (PEDF) is a collagen-binding protein that is abundantly distributed in various tissues, including the eye. It exhibits various biological functions, such as anti-angiogenic, neurotrophic, and neuroprotective activities. PEDF also interacts with extracellular matrix components such as collagen, heparan sulfate proteoglycans (HSPGs), and hyaluronan. The collagen-binding property has been elucidated to be important for the anti-angiogenic activity in vivo (Hosomichi, J., Yasui, N., Koide, T., Soma, K., and Morita, I. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 335, 756-761). Here, we investigated the collagen recognition mechanism by PEDF. We first narrowed down candidate PEDF-binding sequences by taking advantage of previously reported structural requirements in collagen. Subsequent searches for PEDF-binding sequences employing synthetic collagen-like peptides resulted in the identification of one of the critical binding sites for PEDF, human alpha 1(I)(929-938) (IKGHRGFSGL). Further analysis revealed that the collagen recognition by PEDF is sequence-and conformation-specific, and the high affinity binding motif is KGXRG-FXGL in the triple helix. The PEDF-binding motif significantly overlapped with the heparin/HSPG-binding motif, KGHRG(F/Y). The interaction of PEDF with collagen I was specifically competed with by heparin but not by chondroitin sulfate-C or hyaluronan. The binding sequences for PEDF and heparin/HSPG also overlapped with the covalent cross-linking sites between collagen molecules. These findings imply a functional relationship between PEDF and HSPGs during angiogenesis, and the interaction of these molecules is regulated by collagen modifications.

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    47
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  • コラーゲン結合性多機能SERPIN、色素上皮由来因子(PEDF)の構造-機能相関

    関谷敦志, 小出隆規

    酵素工学ニュース   66   20 - 24  2011年

  • A structure-activity relationship study elucidating the mechanism of sequence-specific collagen recognition by the chaperone HSP47

    Yoshimi Nishikawa, Yoshifumi Takahara, Shinichi Asada, Akira Shigenaga, Akira Otaka, Kouki Kitagawa, Takaki Koide

    BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY   18 ( 11 ) 3767 - 3775  2010年06月  [査読有り]

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    Heat-shock protein 47 (HSP47) is a chaperone that facilitates the proper folding of procollagen. Our previous studies showed that the high-affinity HSP47-binding motif in the collagen triple helix is Xaa-(Thr/Pro)-Gly-Xaa-Arg-Gly. In this study, we further investigated structural requirements for the HSP47-binding motif, using synthetic triple-helical collagen-model peptides with systematic amino acid substitutions at either the Thr/Pro (=Yaa(-3)) or the Arg(=Yaa(0)) position. Results obtained from in vitro binding assays indicated that HSP47 detects the side-chain structure of Arg at the Yaa(0)-position, while the Yaa(-3) amino acid serves as the secondary recognition site that affects affinity to HSP47. (C) 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.

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    16
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    (Scopus)
  • A collagen-mimetic triple helical supramolecule that evokes integrin-dependent cell responses

    Chisato M. Yamazaki, Yuichi Kadoya, Kentaro Hozumi, Hitomi Okano-Kosugi, Shinichi Asada, Kouki Kitagawa, Motoyoshi Nomizu, Takaki Koide

    BIOMATERIALS   31 ( 7 ) 1925 - 1934  2010年03月  [査読有り]

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    Collagen is an abundantly distributed extracellular matrix protein in mammalian bodies that maintains structural integrity of the organs and tissues. Besides its function as a structural protein, collagen has various biological functions which regulate cell adhesion, migration and differentiation. In order to develop totally synthetic collagen-surrogates, we recently reported a basic concept for preparing collagen-like triple helical supramolecules based on the self-assembly of staggered trimeric peptides with self-complementary shapes. In this paper, we add one of the specific cellular functions of the native collagen to the collagen-mimetic supramolecule. We synthesized a self-assembling peptide unit containing the integrin-binding sequence Gly-Phe-Hyp-Gly-Glu-Arg. The supramolecule carrying the sequence exhibited significant binding activity to human dermal fibroblasts. The supramolecular structure was found to be essential for function in in vitro cell culture. Cell adhesion was shown to be comparable to that of native collagen, and was further demonstrated to be mediated solely by integrin alpha 2 beta 1. Well-grown focal contacts and stress fibers were observed in cells spread on the supramolecular collagen-mimetic. The results demonstrate the potential of pepticle-based artificial collagen as a biomaterial for regulating specific cellular function and fate. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.

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    50
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    (Scopus)
  • コラーゲン様三重らせんペプチドを利用した生化学研究

    小出 隆規

    生化学   82 ( 6 ) 474 - 483  2010年

    PubMed

  • Development of a high-throughput screening system for the compounds that inhibit collagen-protein interactions

    Hitomi Okano-Kosugi, Osamu Matsushita, Shinichi Asada, Andrew B. Herr, Kouki Kitagawa, Takaki Koide

    ANALYTICAL BIOCHEMISTRY   394 ( 1 ) 125 - 131  2009年11月

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    Collagen-binding proteins (CBPs) play important roles in various physiological events. Some CBPs are regarded as targets for drug development; for example, platelet glycoprotein VI (GPVI) and heat shock protein 47 (HSP47) are promising targets for the development of novel antiplatelet and antifibrotic drugs, respectively. However, no systematic screening method to search compounds that inhibit collagen-CBP interactions have been developed, and only a few CBP inhibitors have been reported to date. In this study, a facile turbidimetric multiwell plate assay was developed to evaluate inhibitors of CBPs. The assay is based on the finding that CBPs retard spontaneous collagen fibril formation in vitro and that fibril formation is restored in the presence of compounds that interfere with the collagen-CBP interactions. Using the same platform, the assay was performed in various combinations of fibril-forming collagen types and CBPs. This homogeneous assay is simple, convenient, and suitable as an automated high-throughput screening system. (C) 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.

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    13
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    (Scopus)
  • Unidirectional Binding of Clostridial Collagenase to Triple Helical Substrates

    Sagaya Theresa Leena Philominathan, Takaki Koide, Kentaro Hamada, Hiroyuki Yasui, Soenke Seifert, Osamu Matsushita, Joshua Sakon

    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY   284 ( 16 ) 10868 - 10876  2009年04月  [査読有り]

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    Histotoxic clostridia produce collagenases responsible for extensive tissue destruction in gas gangrene. The C-terminal collagen-binding domain (CBD) of these enzymes is the minimal segment required to bind to collagen fibril. Collagen binding efficiency of CBD is more pronounced in the presence of Ca(2+). We have shown that CBD can be functional to anchor growth factors in local tissue. A (1)H-(15)N HSQC NMR titration study with three different tropocollagen analogues ((POG)(10))(3), ((GPOG)(7)PRG)(3), and (GPRG(POG)(7)C-carbamidomethyl)(3), mapped a saddle-like binding cleft on CBD. NMR titrations with three nitroxide spin-labeled analogues of collagenous peptide, (PROXYL-G(POG)(7)PRG)(3), (PROXYL-G(POG)(7))(3), and (GPRG(POG)(7)C-PROXYL)(3) (where PROXYL represents 2,2,5,5-tetramethyl-L-pyrrolidinyloxy), unambiguously demonstrated unidirectional binding of CBD to the tropocollagen analogues. Small angle x-rays cattering data revealed that CBD binds closer to a terminus for each of the five different tropocollagen analogues, which in conjunction with NMR titration studies, implies a binding mode where CBD binds to the C terminus of the triple helix.

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    27
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    (Scopus)
  • Artificial Collagen Gels via Self-Assembly of De Novo Designed Peptides

    Chisato M. Yamazaki, Shinichi Asada, Kouki Kitagawa, Takaki Koide

    BIOPOLYMERS   90 ( 6 ) 816 - 823  2008年  [査読有り]

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    Development of artificial collagens to replace the animal-derived collagens presents a challenge in the formation of safer and functional biomaterials. We report here the development of collagen-like gels by means of the self-assembly of chemically synthesized peptides. The peptides are disulfide-linked trimers of collagenous Gly-X-Y triplet repeats with self-complementary shapes. Upon cooling the peptide solutions, hydrogels of peptide supramolecules are formed by spontaneous intermolecular triple helix formation. The thermal gel-sol transition appeared to be reversible and the transition temperatures were found to be tunable by the design of the peptides. Our systems for the formation of artificial collagen-like gels will offer possibilities for novel types of biomaterials. (C) 2008 Wiley Periodicals, Inc. Biopolymers (Pept Sci) 90: 816-823, 2008.

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    65
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    (Scopus)
  • Designed triple-helical peptides as tools for collagen biochemistry and matrix engineering

    Takaki Koide

    PHILOSOPHICAL TRANSACTIONS OF THE ROYAL SOCIETY B-BIOLOGICAL SCIENCES   362 ( 1484 ) 1281 - 1291  2007年08月  [査読有り]

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    Collagens, characterized by a unique triple-helical structure, are the predominant component of extracellular matrices (ECMs) existing in all multicellular animals. Collagens not only maintain structural integrity of tissues and organs, but also regulate a number of biological events, including cell attachment, migration and differentiation, tissue regeneration and animal development. The specific functions of collagens are generally triggered by specific interactions of collagen-binding molecules (membrane receptors, soluble factors and other ECM components) with certain structures displayed on the collagen triple helices. Thus, synthetic triple-helical peptides that mimic the structure of native collagens have been used to investigate the individual collagen-protein interactions, as well as collagen structure and stability. The first part of this article illustrates the design of various collagen-mimetic peptides and their recent applications in matrix biology. Collagen is also acknowledged as one of the most promising biornaterials in regenerative medicine and tissue engineering. However, the use of animal-derived collagens in human could put the recipients at risks of pathogen transmission or allergic reactions. Hence, the production of safe artificial collagen surrogates is currently of considerable interest. The latter part of this article reviews recent attempts to develop artificial collagens as novel biomaterials.

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    69
    被引用数
    (Scopus)
  • An Improved Synthesis of Collagen-model peptides by the Use of 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium Chloride (DMT-MM) as a Coupling Reagent

    D. L. Homma, K. Kitagawa, T. Koide

        139-140  2006年04月

  • Specific recognition of the collagen triple helix by chaperone HSP47 II. The HSP47-binding structural motif in collagens and related proteins

    T Koide, Y Nishikawa, S Asada, CM Yamazaki, Y Takahara, DL Homma, A Otaka, K Ohtani, N Wakamiya, K Nagata, K Kitagawa

    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY   281 ( 16 ) 11177 - 11185  2006年04月  [査読有り]

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    The endoplasmic reticulum-resident chaperone heat-shock protein 47 (HSP47) plays an essential role in procollagen biosynthesis. The function of HSP47 relies on its specific interaction with correctly folded triple-helical regions comprised of Gly-Xaa-Yaa repeats, and Arg residues at Yaa positions have been shown to be important for this interaction. The amino acid at the Yaa position (Yaa(-3)) in the N-terminal-adjoining triplet containing the critical Arg ( defined as Arg(0)) was also suggested to be directly recognized by HSP47 (Koide, T., Asada, S., Takahara, Y., Nishikawa, Y., Nagata, K., and Kitagawa, K. ( 2006) J. Biol. Chem. 281, 3432 - 3438). Based on this finding, we examined the relationship between the structure of Yaa(-3) and HSP47 binding using synthetic collagenous peptides. The results obtained indicated that the structure of Yaa(-3) determined the binding affinity for HSP47. Maximal binding was observed when Yaa(-3) was Thr. Moreover, the required relative spatial arrangement of these key residues in the triple helix was analyzed by taking advantage of heterotrimeric collagen-model peptides, each of which contains one Thr(-3) and one Arg(0). The results revealed that HSP47 recognizes the Yaa(-3) and Arg(0) residues only when they are on the same peptide strand. Taken together, the data obtained led us to define the HSP47-binding structural epitope in the collagen triple helix and also define the HSP47-binding motif in the primary structure. A motif search against human protein database predicted candidate clients for this molecular chaperone. The search result indicated that not all collagen family proteins require the chaperoning by HSP47.

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    68
    被引用数
    (Scopus)
  • Specific recognition of the collagen triple helix by chaperone HSP47: Minimal structural requirement and spatial molecular orientation

    Takaki Koide, Shinichi Asada, Yoshifumi Takahara, Yoshimi Nishikawa, Kazuhiro Nagata, Kouki Kitagawa

    Journal of Biological Chemistry   281 ( 6 ) 3432 - 3438  2006年02月

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    The unique folding of procollagens in the endoplasmic reticulum is achieved with the assistance of procollagen-specific molecular chaperones. Heat-shock protein 47 (HSP47) is an endoplasmic reticulum-resident chaperone that plays an essential role in normal procollagen folding, although its molecular function has not yet been clarified. Recent advances in studies on the binding specificity of HSP47 have revealed that Arg residues at Yaa positions in collagenous Gly-Xaa-Yaa repeats are critical for its interactions (Koide, T., Takahara, Y., Asada, S., and Nagata, K. (2002) J. Biol. Chem. 277, 6178-6182
    Tasab, M., Jenkinson, L., and Bulleid, N. J. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35007-35012). In the present study, we further examined the client recognition mechanism of HSP47 by taking advantage of systems employing engineered collagen model peptides. First, in vitro binding studies using conformationally constrained collagen-like peptides revealed that HSP47 only recognized correctly folded triple helices and that the interaction with the corresponding single-chain polypeptides was negligible. Second, a binding study using heterotrimeric model clients for HSP47 demonstrated aminimal requirement for the number of Arg residues in the triple helix. Finally, a cross-linking study using photoreactive collagenous peptides provided information about the spatial orientation of an HSP47 molecule in the chaperone-collagen complex. The obtained results led to the development of a new model of HSP47-collagen complexes that differs completely from the previously proposed "flying capstan model" (Dafforn, T. R., Della, M., and Miller, A. D. (2001) J. Biol. Chem. 276, 49310-49319). © 2006 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

    DOI PubMed

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    53
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    (Scopus)
  • Self-complementary peptides for the formation of collagen-like triple helical supramolecules

    T Koide, DL Homma, S Asada, K Kitagawa

    BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS   15 ( 23 ) 5230 - 5233  2005年12月  [査読有り]

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    Collagen is acknowledged as one of the most prominent biomaterials on account of its high biocompatibility and biostability. The development of artificial collagens to replace the animal-derived collagens presents a challenge in the formation of safer and highly functionalized biomaterials. Here, a novel peptide-based system for obtaining collagen-like supramolecules via a spontaneous self-assembling process is described. The designed collagen-like peptides are self-complementary trimers in which each of the 24-mer peptide strands is tethered by two cystine knots forming a staggered arrangement. Their self-assembling ability in aqueous solution was analyzed by circular dichroism, ultrafiltration, and laser diffraction particle size estimation. The obtained results indicate that the staggered trimers form large supramolecular architectures through intermolecular triple helix-formation. (c) 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved.

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    67
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    (Scopus)
  • Involvement of the collagen I-binding motif in the anti-angiogenic activity of pigment epithelium-derived factor

    J Hosomichi, N Yasui, T Koide, K Soma, Morita, I

    BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS   335 ( 3 ) 756 - 761  2005年09月  [査読有り]

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    Pigment epithelium-derived factor (PEDF) is the most potent endogenous inhibitor of angiogenesis in age-related macular degeneration and tumors. However, the molecular mechanism of the anti-angiogenic activity of PEDF is poorly understood. PEDF interacts with the extracellular matrix (ECM) in vitro. Here, we investigated the possible involvement of the motif for ECM interaction in the anti-angiogenic activity of PEDF. The growth rates of HeLa cells in culture were not affected by transfection of PEDF, indicating that PEDF did not suppress tumor cell growth directly. In tumor xenografts, the overexpression of wild-type PEDF significantly suppressed tumor growth, whereas a mutant of the collagen I-binding site of PEDF (Col-mut PEDF) did not inhibit tumor growth. A mutant of the heparin-binding site of PEDF (Hep-mut PEDF) suppressed tumor growth. Histological analysis showed that the density and area of microvasculatures in either PEDF or Hep-mut PEDF were suppressed when compared with those in either vector or Col-mut PEDF. Our data indicate that PEDF inhibits tumor growth via its anti-angiogenic activity, and the collagen I-binding motif of PEDF is involved in the biological activity. (C) 2005 Elsevier Inc. All rights reserved.

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    45
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    (Scopus)
  • Triple helical collagen-like peptides: Engineering and applications in matrix biology

    T Koide

    CONNECTIVE TISSUE RESEARCH   46 ( 3 ) 131 - 141  2005年  [査読有り]

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    Collagen, a large insoluble protein with a characteristic triple helical structure, is found as the most prominent component of extracellular matrix. The functions of collagen are not limited to providing mechanical strength to various tissues and organs as a structural protein, as it has been pointed out that collagen exhibits various biological functions through specific interactions with other macromolecules. However, the use of native triple helical collagen is often troublesome because of its insolubility and gelating properties. Instead, triple helical collagen-like peptides have been designed and are used as collagen surrogates in studies on collagen structure, stability, and biological functions including binding to other proteins and cultured cells. This article reviews recent progress in peptide design, synthesis, and the applications of collagen-like peptides in current matrix biology, while emphasizing the advantages of the peptide-based strategy.

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    61
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    (Scopus)
  • Collagen biosynthesis

    T Koide, K Nagata

    COLLAGEN   247   85 - 114  2005年  [査読有り]

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    Collagen is synthesized in the endoplasmic reticulum (ER) as pro collagen, which is the precursor protein that bears propeptide domains at either end of the triple helical domain. The processes by which procollagen is synthesized in the lumen of the ER include unique steps that are not found in the biosynthesis of globular proteins. First, each polypeptide chain of procollagen (pro alpha-chains) finds its correct partners, which enables the formation of the distinct types of procollagen. Second, triple helix-formation of long Gly-X-Y repeats starts at a defined region, which results in the formation of a correctly aligned triple helix and thereby prevents mis-staggering. The most characteristic step is the formation of the triple helix. This step involves specific post-translational modifications, in particular, the prolyl 4-hydroxylation of the Upsilon-position amino acids that stabilizes the triple helical conformation. The formation of the triple helix is a slow process compared to the folding of globular proteins, including cis-trans isomerization of the many prolyl and hydroxyprolyl peptide bonds. Recent advances have indicated that these processes are assisted by a set of the ER-resident molecular chaperones, such as protein disulfide isomerase (PDI), peptidyl prolyl cis-trans isomerases (PPIases), heat-shock protein (Hsp)47, and prolyl 4-hydroxylase (P4-H). The intracellular trafficking of procollagen molecules has also been shown to involve a pathway distinct from that utilized by small secretory proteins.

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    43
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    (Scopus)
  • コラーゲンの構造形成を実現する分子シャペロン Hsp 47

    小出 隆規

    蛋白質 核酸 酵素 増刊号「細胞における蛋白質の一生」   49   870 - 874  2004年

  • Synthesis of heterotrimeric collagen models containing Arg residues in Y-positions and analysis of their conformational stability

    T Koide, Y Nishikawa, Y Takahara

    BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS   14 ( 1 ) 125 - 128  2004年01月  [査読有り]

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    An Arg residue incorporated into the Y-position of collagenous host-guest peptide Ac-(Gly-Pro-Hyp)(3)-Gly-Pro-Y-(Gly-Pro-Hyp)(4)-Gly-Gly-NH2 is reported to stabilize the triple helical structure as well as a 4(R)-hydroxyproline (Hyp) residue. Here, we synthesized heterotrimeric collagen models containing Arg in Y-positions utilizing the cystine knot strategy. Analysis of their thermal transition temperatures using circular dichroism spectrometry demonstrated unexpected decrease in the triple helical stability as the number of Arg increased. The obtained results indicated that an Arg residue in a Y-position is not always an equivalent of a Hyp residue, and that it possesses a potential helix destabilizing effect. (C) 2003 Elsevier Ltd. All rights reserved.

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    29
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    (Scopus)
  • Collagen-protein interactions mapped by phototriggered thiol introduction

    N Yasui, T Koide

    JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY   125 ( 51 ) 15728 - 15729  2003年12月  [査読有り]

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    15
    被引用数
    (Scopus)
  • Dual-site recognition of different extracellular matrix components by anti-angiogenic/neurotrophic serpin, PEDF

    N Yasui, T Mori, D Morito, O Matsushita, H Kourai, K Nagata, T Koide

    BIOCHEMISTRY   42 ( 11 ) 3160 - 3167  2003年03月  [査読有り]

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    Pigment epithelium-derived factor (PEDF), a member of the serine protease inhibitor (serpin) superfamily, possesses anti-angiogenic and neurotrophic activities. PEDF has been reported to bind to extracellular matrix (ECM) components such as collagens and glycosaminoglycans (GAGs). In this study, to determine the binding sites for collagens and GAGs, we analyzed the interaction of recombinant mouse PEDF (rPEDF) with collagen I and heparin. By utilizing residue-specific chemical modification and site-directed mutagenesis techniques, we revealed that the acidic amino acid residues on PEDF (Asp(255), Asp(257), and Asp(299)) are critical to collagen binding, and three clustered basic amino acid residues (Arg(145). Lys(146), and Arg(148)) are necessary for heparin binding. Mapping of these residues on the crystal structure of human PEDF (Simonovic, M., Gettins, P. G. W., and Volz, K. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11131-11135) demonstrated that the collagen-binding site is oriented toward the opposite side of the highly basic surface where the heparin-binding site is localized. These results indicate that PEDF possesses dual binding sites for different ECM components, and this unique localization of ECM-binding sites implies that the binding to ECM components could regulate PEDF activities.

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    60
    被引用数
    (Scopus)
  • Metal-assisted stabilization and probing of collagenous triple helices

    T Koide, M Yuguchi, M Kawakita, H Konno

    JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY   124 ( 32 ) 9388 - 9389  2002年08月  [査読有り]

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    65
    被引用数
    (Scopus)
  • Xaa-Arg-Gly triplets in the collagen triple helix are dominant binding sites for the molecular chaperone HSP47

    T Koide, Y Takahara, S Asada, K Nagata

    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY   277 ( 8 ) 6178 - 6182  2002年02月  [査読有り]

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    HSP47 is an essential procollagen-specific molecular chaperone that resides in the endoplasmic reticulum of procollagen-producing cells. Recent advances have revealed that HSP47 recognizes the (Pro-Pro-Gly)(n) sequence but not (Pro-Hyp-Gly)(n) and that HSP47 recognizes the triple-helical conformation. In this study, to better understand the substrate recognition by HSP47, we synthesized various collagen model peptides and examined their interaction with HSP47 in vitro. We found that the Pro-Arg-Gly triplet forms an HSP47-binding site. The HSP47 binding was observed only when Arg residues were incorporated in the Xaa positions of the Xaa-Yaa-Gly triplets. Amino acids in the Xaa position did not largely affect the interaction. The recognition of the Arg residue by HSP47 was specific to its side-chain structure because replacement of the Arg residue by other basic amino acids decreased the affinity to HSP47. The significance of Arg residues in HSP47 binding was further confirmed by using residue-specific chemical modification of types I and III collagen. Our results demonstrate that Xaa-Arg-Gly sequences in the triple-helical procollagen molecule are dominant binding sites for HSP47 and enable us to predict HSP47-binding sites in homotrimeric procollagen molecules.

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    85
    被引用数
    (Scopus)
  • Substrate recognition by the collagen-binding domain of Clostridium histolyticum class I collagenase

    O Matsushita, T Koide, R Kobayashi, K Nagata, A Okabe

    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY   276 ( 12 ) 8761 - 8770  2001年03月  [査読有り]

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    Clostridium histolyticum type I collagenase (ColG) has a segmental structure, S1+S2+S3a+S3b. S3a and S3b bound to insoluble collagen, but S2 did not, thus indicating that S3 forms a collagen-binding domain (CBD). Because S3a+S3b showed the most efficient binding to substrate, cooperative binding by both domains was suggested for the enzyme. Monomeric (S3b) and tandem (S3a+S3b) CBDs bound to atelocollagen, which contains only the collagenous region. However, they did not bind to telopeptides immobilized on Sepharose beads. These results suggested that the binding site(s) for the CBD is(are) present in the collagenous region. The CBD bound to immobilized collagenous peptides, (Pro-Hyp-Gly)(n) and (Pro-Pro-Gly)(n), only when n is large enough to allow the peptides to have a triple-helical conformation. They did not bind to various peptides with similar amino acid sequences or to gelatin, which lacks a triple-helical conformation, The CBD did not bind to immobilized Glc-Gal disaccharide, which is attached to the side chains of hydroxylysine residues in the collagenous region. These observations suggested that the CBD specifically recognizes the triple helical conformation made by three polypeptide chains in the collagenous region.

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    105
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    (Scopus)
  • Molecular cloning of a novel ubiquitin-like protein, UBIN, that binds to ER targeting signal sequences

    M Matsuda, T Koide, T Yorihuzi, N Hosokawa, K Nagata

    BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS   280 ( 2 ) 535 - 540  2001年01月  [査読有り]

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    To identify proteins that interact with HSP47, an endoplasmic reticulum (ER)-resident molecular chaperone, a yeast two-hybrid screening was performed using mouse full-length HSP47 including an N-terminal signal sequence as a bait. Analysis of several positive clones led to the identification and cloning of a novel gene, ubin, encoding a ubiquitin-like protein. Unlike other ubiquitin-like proteins, UBIN was shown to interact with signal sequences of various secretory and ER-luminal proteins, including HSP47, but not interact with signal sequences of mitochondrial targeting in two-hybrid system. The possible function of UBIN will be discussed with regards to novel characteristics of binding to signal sequences for ER targeting. (C) 2001 Academic Press.

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    19
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    (Scopus)
  • Conformational requirements of collagenous peptides for recognition by the chaperone protein HSP47

    T Koide, A Aso, T Yorihuzi, K Nagata

    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY   275 ( 36 ) 27957 - 27963  2000年09月  [査読有り]

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    The collagen binding chaperone HSP47 interacts with procollagen in the endoplasmic reticulum and plays a crucial role in the biosynthesis of collagen. We recently demonstrated that typical collagen model peptides, (Pro-Pro-Gly)(n), possess sufficient structural information for interaction with HSP47 (Koide, T., Asada, S., and Nagata, K. (1999) J. Biol. Chem. 274, 34523-34526). Here we show that binding of (Gly-Pro-Pro), peptides to HSP47 can be detected using the two-hybrid system in yeast if a trimerizing domain is fused to the C termini of the peptides. Some peptides interacted with HSP47 at a lowered assay temperature at 24 degrees C but not at 30 degrees C, indicating the importance of conformational change of the substrate peptides, To analyze the spectrum of HSP47 substrate sequences, we performed two-hybrid screening of collagen-like peptides in designed random peptide libraries using HSP47 as a bait. In selected peptides, the enrichment ratio calculated for each amino acid residue correlated strongly with the contribution of the residue to triple-helix stability independently determined using synthetic collagen model peptides. Taken together, our results suggest that HSP47 preferentially recognizes collagenous Gly-X-Y repeats in triple-helical conformation. We also demonstrated that screening of combinatorial peptide libraries is a powerful strategy to determine conformational requirements as web as the elucidation of binding motifs in primary structure.

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    57
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  • ジャクスタクリンとマトリクリン-成長因子の新しい作用様式

    小出 隆規, 伊藤嘉浩

    生化学   72   1259 - 1263  2000年

  • Substrate recognition of collagen-specific molecular chaperone HSP47 - Structural requirements and binding regulation

    T Koide, S Asada, K Nagata

    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY   274 ( 49 ) 34523 - 34526  1999年12月  [査読有り]

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    Prior to secretion, procollagen molecules are correctly folded to triple helices in the endoplasmic reticulum (ER). HSP47 specifically associates with procollagen in the ER during its folding and/or modification processes and is thought to function as a collagen-specific molecular chaperone (Nagata, K, (1996) Trends Bio chem. Sci, 21, 23-26), However, structural requirements for substrate recognition and regulation of the binding have not yet been elucidated. Here, we show that a typical collagen model sequence, (Pro-Pro-Gly)(n), possesses sufficient structural information required for recognition by HSP47. A structure-activity relationship study using synthetic analogs of (Pro-Pro-Gly)(n) has revealed the requirements in both chain length and primary structure for the interaction. The substrate recognition of HSP47 has also been shown to be similar but distinct from that of prolyl 4-hydroxylase, an ER resident enzyme, Further, it has shown that the interaction of HSP47 with the substrate peptides is abolished by prolyl 4-hydroxylation of the second Pro residues in Pro-Pro-Gly triplets and that the fully prolyl 4-hydroxylated peptide, (Pro-Hyp-Gly)(n), does not interact with HSP47, We thus have proposed a model in which HSP47 dissociates from procollagen during the process of prolyl 4-hydroxylation in the ER.

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    56
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    (Scopus)
  • Effect of HSP47 on prolyl 4-hydroxylation of collagen model peptides

    S Asada, T Koide, H Yasui, K Nagata

    CELL STRUCTURE AND FUNCTION   24 ( 4 ) 187 - 196  1999年08月  [査読有り]

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    Prolyl 4-hydroxylation, the most important post-translational modification in collagen biosynthesis, is catalyzed by prolyl 4-hydroxylase, an endoplasmic reticulum-resident enzyme. HSP47 is a collagen-binding stress protein which also resides in the endoplasmic reticulum (Nagata, K. and Yamada, K.M. (1986) J. Biol. Chem., 261, 7531-7536). Both prolyl 4-hydroxylase and HSP47 interact with procollagen alpha-chains during their folding and/or modification in the endoplasmic reticulum. Recent study has revealed that a simple collagen model peptide, (Pro-Pro-Gly)(n), is recognized by HSP47 as well as by prolyl 4-hydroxylase in vitro (Koide et al., manuscript submitted). In the present study, we investigated the effect of HSP47 on the prolyl 4-hydroxylation of such collagen model peptides. To monitor the enzymatic hydroxylation of the peptides, we developed a non-RI assay system based on reversed-phase HPLC. When HSP47 was added to the reaction mixture, substrate and less-hydroxylated materials accumulated. This effect depended on the peptide-binding activity of HSP47, because a mutant HSP47 without collagen-binding activity did not show any inhibitory effect on prolyl 4-hydroxylation. Kinetic analysis and other biochemical analyses suggest that HSP47 retards the enzymatic reaction competing for the substrate peptide.

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    10
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    (Scopus)
  • コラーゲン生合成に関わる分子シャペロン HSP47

    小出 隆規, 永田和宏

    Connective Tissue   30   307 - 314  1998年

  • 熱ショック蛋白質(HSP)

    小出 隆規

    医学のあゆみ   181   817 - 818  1997年

  • A convenient one-pot synthesis of cystine-containing peptides from protected peptidyl resins using the trimethylsilyl chloride dimethyl sulfoxide trifluoroacetic acid system

    H Tamamura, T Ishihara, A Otaka, T Koide, K Miyoshi, T Ibuka, N Fujii

    JOURNAL OF THE CHEMICAL SOCIETY-PERKIN TRANSACTIONS 1   1996 ( 16 ) 1911 - 1912  1996年08月  [査読有り]

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    Cystine-containing peptides are obtained in a one-pot manner by treatment of protected peptidyl resins with trimethylsilyl chloride (TMSCl)-dimethyl sulfoxide (DMSO)-trifluoroacetic acid (TFA), The TMSCl-DMSO-TFA system simultaneously cleaves peptides from the resins, with deprotection of all side chain protecting groups and disulfide bond formation.

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    5
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    (Scopus)
  • DISULFIDE BOND-FORMING REACTION USING A DIMETHYL-SULFOXIDE AQUEOUS HCL SYSTEM AND ITS APPLICATION TO REGIOSELECTIVE 2 DISULFIDE BOND FORMATION

    H TAMAMURA, A OTAKA, J NAKAMURA, K OKUBO, T KOIDE, K IKEDA, T IBUKA, N FUJII

    INTERNATIONAL JOURNAL OF PEPTIDE AND PROTEIN RESEARCH   45 ( 4 ) 312 - 319  1995年04月  [査読有り]

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    Disulfide bond formation in S-acetamidomethyl (Acm) cysteine-containing peptides by successive treatments with silver trifluoromethanesulfonate (AgOTf) and dimethyl sulfoxide (DMSO)/aqueous HCl is described. An S-Acm cysteine was found to be quantitatively converted into cystine by deprotection of the Acm group with AgOTf followed by DMSO/aqueous HCl treatment. Under these reaction conditions, no significant side reactions were observed with oxidation-sensitive amino acids such as Met, Tyr and Trp. Oxytocin and a Trp-containing peptide, urotensin II, were prepared by this method. Furthermore, regioselective two disulfide bond formation was found to be feasible by the combination of air oxidation and the AgOTf-DMSO/HCl system. This strategy has been successfully applied to the syntheses of tachyplesin I and endothelin I, which have two disulfide bonds and a Trp residue in the molecule. (C) Munksgaard 1995.

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    31
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    (Scopus)
  • INTERACTIONS BETWEEN COLLAGEN-BINDING STRESS PROTEIN HSP47 AND COLLAGEN - ANALYSIS OF KINETIC-PARAMETERS BY SURFACE-PLASMON RESONANCE BIOSENSOR

    T NATSUME, T KOIDE, S YOKOTA, K HIRAYOSHI, K NAGATA

    JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY   269 ( 49 ) 31224 - 31228  1994年12月  [査読有り]

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    A 47-kDa heat shock protein (HSP47) is a collagen-binding stress protein which is localized in the endoplasmic reticulum (ER) of collagen secreting cells. Recent studies have shown that HSP47 transiently binds to newly synthesized procollagens and that conformationally abnormal procollagen is also bound by HSP47 for a much longer time in the ER (Nakai, A, Satoh, M., Hirayoshi, K., and Nagata, K. (1992) J. Cell Biol. 117, 903-914). HSP47 is thus suggested to have a collagen-specific molecular chaperone-like function. In this report, we analyzed the interaction of HSP47 and types I to V collagen using BIAcore(TM) system, an optical biosensor based on the principles of surface plasmon resonance. Types I-V collagen were purified from porcine skin, porcine articular cartilage, bovine lens capsule, and porcine placenta and immobilized on sensorchips of the BIAcore(TM) system at a surface concentration of 10-15 ng/mm(2). Purified recombinant mouse HSP47 (rmHSP47) expressed in Escherichia coli was passed over the sensorchips at a now rate of 2 mu l/min and binding curves of rmHSP47 to collagens were monitored. Using this approach, accurate association and dissociation rate constants were determined in addition to dissociation constants. rmHSP47 was found to bind to types I-V collagen with similar dissociation constants of the order of 10(-7) M. This relatively low dissociation constant resulted from the rapid dissociation rate constant (k(diss) &gt; 10(-2) s(-1)) and considerably high (k(ass) approximate to 2 x 10(4) m(-1) s(-1)) association rate constant. These kinetic parameters may reflect a transient interaction between HSP47 and procollagen in vivo.

  • Molecular Parameters for the Anti-Human Immunodeficiency Virus Activity of T22 ([Tyr5,12, Lys7]-Polypheniusin II)

    Akira Otaka, Hirokazu Tamamura, Yoshihiro Terakawa, Masao Masuda, Takaki Koide, Katsumi Matsuzaki, Koichiro Miyajima, Toshiro Ibuka, Nobutaka Fujii

    Biological and Pharmaceutical Bulletin   17 ( 12 ) 1669 - 1672  1994年

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    T22 ([Tyr5,12, Lys7]-polyphemusin II) was found to exhibit strong anti-human immunodeficiency virus (HIV) activity and exert its effects on a virus-cell fusion process. In the present study, the all-D enantiomer of T22 and its related compounds were synthesized to examine the molecular parameters required for the interaction of T22 with membrane components of cells or viruses in order to exert this anti-HIV activity. The anti-HIV activity of these analogs was investigated in comparison with their membrane permeability with aspect to large unilamellar vesicles (LUVs). The all-D enantiomer of T22 exhibited a 20-fold lower anti-HIV activity compared with T22, whereas they both showed the same membrane permeability. No positive correlation between anti-HIV activity and membrane permeability was observed. These results suggest that the anti-HIV activity of T22 is mediated through the interaction with chiral component(s) of the cell or virus. © 1994, The Pharmaceutical Society of Japan. All rights reserved.

    DOI PubMed

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    10
    被引用数
    (Scopus)
  • DISULFIDE BOND FORMATION IN S-ACETAMIDOMETHYL CYSTEINE-CONTAINING PEPTIDES BY THE COMBINATION OF SILVER TRIFLUOROMETHANESULFONATE AND DIMETHYLSULFOXIDE-AQUEOUS HCL

    H TAMAMURA, A OTAKA, J NAKAMURA, K OKUBO, T KOIDE, K IKEDA, N FUJII

    TETRAHEDRON LETTERS   34 ( 31 ) 4931 - 4934  1993年07月  [査読有り]

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    S-Acetamidomethyl (Acm) cysteine was found to be converted quantitatively to cystine by deprotection of the Acm group with silver trifluoromethanesulfonate (AgOTf) followed by dimethylsulfoxide (DMSO) / aqueous hydrochloric acid (HCI) treatment. No significant side reactions were observed with oxidation-sensitive amino acids such as Met, Tyr, and Trp under these reaction conditions. This method has been applied successfully to the syntheses of oxytocin and a Trp-containing peptide, urotensin II.

    DOI

    Scopus

    29
    被引用数
    (Scopus)
  • Syntheses and Biological Activities of Selenium Analogs of α-Rat Atrial Natriuretic Peptide1)

    Takaki Koide, Hiromi Itoh, Akira Otaka, Nobutaka Fuji, Mayumi Furuya, Yasuo Kitajima

    Chemical and Pharmaceutical Bulletin   41 ( 9 ) 1596 - 1600  1993年

     概要を見る

    a-Rat atrial natriuretic peptide (7—28) (rANP (7—28)) and a series of its analogs in which half cystine residue(s) were substituted with half selenocystine residue(s) were synthesized by using the Fmoc-based solid-phase method followed by cyclization by means of dimethylsulfoxide (DMSO)-trifluoroacetic acid (TFA) oxidation. These analogs possess comparable activities in both receptor binding and cGMP accumulation in rat vascular smooth muscle cells to those of rAMP (7—28). © 1993, The Pharmaceutical Society of Japan. All rights reserved.

    DOI PubMed

    Scopus

    15
    被引用数
    (Scopus)
  • Synthetic Study on Selenocystine-Containing Peptides

    Takaki Koide, Hiromi Itoh, Akira Otaka, Hiroyuki Yasui, Masataka Kuroda, Nobutaka Fujii, Nobuyoshi Esaki, Kenji Soda

    Chemical and Pharmaceutical Bulletin   41 ( 3 ) 502 - 506  1993年

     概要を見る

    N-9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Se-4-methoxybenzylselenocysteine [Fmoc-Sec(MBzl)-OH] was synthesized from selenocystine and successfully applied to Fmoc-based solid-phase peptide synthesis. The stability and the deprotection conditions of the Se-MBzl group were examined. The diselenide bond of a peptide was directly and effectively established between Sec(MBzl) residues by treatment with iodine or the dimethyl sulfoxide-trifluoroacetic acid system. Reduction kinetics of diselenide and disulfide in model peptides by reduced glutathione were also studied comparatively. © 1993, The Pharmaceutical Society of Japan. All rights reserved.

    DOI PubMed

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    70
    被引用数
    (Scopus)
  • Investigation of the Dimethylsulfoxide-Trifluoroacetic Acid Oxidation System for the Synthesis of Cystine-Containing Peptides

    Takaki Koide, Akira Otaka, Nobutaka Fujii

    Chemical and Pharmaceutical Bulletin   41 ( 6 ) 1030 - 1034  1993年

     概要を見る

    Disulfide bonds of peptides were effectively established between S-protected cysteine residues as well as free cysteine residues by the action of dimethylsulfoxide in trifluoroacetic acid. Oxytocin and a-human calcitonin gene-related peptide were synthesized using this oxidation system. The feasibility of this method for the formation of two disulfide bridges of apamin was also examined. © 1993, The Pharmaceutical Society of Japan. All rights reserved.

    DOI PubMed

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    20
    被引用数
    (Scopus)
  • Selective conversion of S-protected cysteine derivatives to cystine by various sulphoxide-silyl compound / trifluoroacetic acid systems

    T. Koide, A. Otaka, H. Suzuki, N. Fujii

    Synlett   23 ( 5 ) 345 - 346  1992年02月

    DOI

  • APPLICATION OF DIMETHYLSULPHOXIDE(DMSO)/TRIFLUOROACETIC ACID(TFA) OXIDATION TO THE SYNTHESIS OF CYSTINE-CONTAINING PEPTIDE

    A OTAKA, T KOIDE, A SHIDE, N FUJII

    TETRAHEDRON LETTERS   32 ( 9 ) 1223 - 1226  1991年02月  [査読有り]

     概要を見る

    S-protected cysteine derivatives [Cys(Trt), Cys(MBzl), Cys(Dbs), Cys(Bzh)] as well as cysteine were converted to cystine by the action of DMSO/TFA; as examples, two model peptides, oxytocin and an alpha-human calcitonin gene-related peptide (alpha-hCGRP), were prepared by this reaction.

    DOI

    Scopus

    79
    被引用数
    (Scopus)
  • S-BENZYLOXYMETHYLCYSTEINE, ITS PROPERTIES AND APPLICATION IN THE SYNTHESIS OF PORCINE BRAIN NATRIURETIC PEPTIDE (pBNP)1, 2)

    Akira Otaka, Hiroshi Morimoto, Nobutaka Fuji, Takaki Koide, Susumu Funakoshi, Haruaki Yajima

    Chemical and Pharmaceutical Bulletin   37 ( 2 ) 526 - 528  1989年

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    The properties of S-benzyloxymethylcysteine, Cys(Bom), were examined. The S-Bom group is stable to trifluoroacetic acid (TFA), but is easily cleaved by treatment with silver trifluoromethanesulfonate (AgOTf)/TFA or 1 M trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate (TMSOTf)-thioanisole/TFA. Cys(Bom) can be converted to cystine by treatment with thallium(lll) triffuoroacetate. Cys(Bom) was successfully applied to the Fmoc-based solid phase synthesis of porcine brain natriuretic peptide (pBNP), a 26-residue peptide with one disulfide bond [Fmoc.9-fluorenylmethytoxycarbonyl]. In the final step, the peptide-resin was first treated with AgOTf/TFA, then with 1 M trimethylsilyl bromide-thioanisole/TFA. After dithiothreitol treatment and subsequent air-oxidation, a homogeneous pBNP was obtained in 17% yield, based on the first amino acid loaded on the resin. The result was compared with those produced by other alternative deprotecting procedures. © 1989, The Pharmaceutical Society of Japan. All rights reserved.

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    8
    被引用数
    (Scopus)

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書籍等出版物

  • 「科学者の研究倫理-化学・ライフサイエンスを中心に」

    田中智之, 小出隆規, 安井裕之

    東京化学同人  2018年06月

Misc

  • 細菌性コラゲナーゼのコラーゲン・アンカーと歯周組織再生への応用(Collagen anchors of bacterial collagenases and their application to periodontal tissue regeneration)

    松下 治, 美間 健彦, 後藤 和義, 山本 由弥子, Perry Caviness, Sakon Joshua, 小出 隆規, 内田 健太郎, 中村 心, 高柴 正悟

    日本細菌学雑誌   74 ( 1 ) 84 - 84  2019年03月

  • コラーゲン様ペプチドのコンフォメーション依存的な細胞内への移行

    山崎ちさと, 中瀬生彦, 遠藤裕之, 岸本沙耶, 増山祥弘, 二木史朗, 小出隆規

    第49回ペプチド討論会 ,かごしま県民交流センター(鹿児島)    2012年11月  [査読有り]

  • 細胞内に移行するコラーゲン様ペプチドのデザイン

    小出隆規, 遠藤裕之, 中瀬生彦, 二木史朗

    第3回関東支部大会 ,東京    2009年09月  [査読有り]

  • コラーゲン特異的分子シャペロンHSP47の網羅的基質検索

    浅田真一, 西川良美, 高原佳史, 山崎ちさと, 本間大輔, 大高章, 永田和宏, 北川幸己, 小出隆規

    日本薬学会年会要旨集   126th ( 3 )  2006年

    J-GLOBAL

  • 新規ジスルフィド形成法の開発とTrp含有ペプチドへの応用

    玉村啓和, 中村純子, 大久保かおり, 大高章, 小出隆規, 藤井信孝

    日本薬学会年会要旨集   113th ( Pt 2 )  1993年

    J-GLOBAL

産業財産権

  • 抗菌生物活性を有するコラーゲン様ペプチド及びその組成物

    小出 隆規, 増田 亮, 工藤 正和, 太宰 結

    特許権

  • コラーゲン様ペプチドからなる薬物担体

    山崎 ちさと, 安井 裕之, 高尾 敏文, 粟田 ちひろ, 小出 隆規

    特許権

  • コラーゲンへの結合活性を有する環状ペプチド

    特許権

  • コラーゲン様構造を有する重合ペプチド及びゲル

    特許6455862

    小出 隆規, 市瀬 慎一郎, 竹内 俊吾, 能勢 博

    特許権

共同研究・競争的資金等の研究課題

  • 酵母に発現させた3重らせん型ランダムペプチドライブラリからの創薬リードの探索

    研究期間:

    2020年04月
    -
    2023年03月
     

     概要を見る

    ペプチドは、低分子量医薬品や抗体医薬の中間のサイズを有する分子であり、これらの特長を併せ持つことができるポテンシャルを有している。しかしながら、一般的なペプチドは生体内で容易に分解される。本研究で用いる3重らせん型ペプチドは、生体内での易分解性を克服している。したがって、生物活性を有する3重らせん型ペプチドは医薬品のリードとなることが期待される。本研究では、ランダムで多様な3重らせん型ペプチドのライブラリから、生物活性を有するペプチドを取得することを目的とするものである

  • テネイシンXーTRPチャネル系を標的とした神経麻痺性角膜症の新規治療戦略の確立

    研究期間:

    2018年04月
    -
    2023年03月
     

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    【目的】TNX欠失(KO)マウスでは角膜上皮創傷治癒における角膜知覚神経の形態形成と角膜上皮創傷治癒過程での神経ペプチド発現の変化をC57/BL6(WT)マウスと比較検討した。【方法】(1)片眼に直径2mmの角膜上皮欠損モデルを作製した。創閉鎖まで6時間おきにフルオレスセインで染色し、角膜上皮欠損の治癒過程を実体顕微鏡で撮影し欠損残存面積を統計学的に比較検討した。また各ステージごとに 眼球を摘出し、パラフィン切片を作成後、組織学的、免疫組織学的に比較検討した。(2) 同モデルで経時的に屠殺後摘出したWTとKOマウスの角膜をTUJ1で免疫染色し、フラットマウント標本で蛍光顕微鏡下で観察し、角膜知覚神経の形態と再生の程度を比較検討した。(3)WTとKOマウスを使用しコシェボネ角膜知覚計を用いて角膜知覚を計測し比較検討した。【結果】(1)KOマウスではWTマウスと比較し角膜上皮欠損の閉鎖が12時間後、18時間後、24時間後で有意に著明に遅延した。テネイシンX

  • テネイシンXーTRPチャネル系を標的とした神経麻痺性角膜症の新規治療戦略の確立

    科学研究費助成事業(早稲田大学)  科学研究費助成事業(基盤研究(C))

    研究期間:

    2018年04月
    -
    2023年03月
     

     概要を見る

    【目的】TNX欠失(KO)マウスでは角膜上皮創傷治癒における角膜知覚神経の形態形成と角膜上皮創傷治癒過程での神経ペプチド発現の変化をC57/BL6(WT)マウスと比較検討した。【方法】(1)片眼に直径2mmの角膜上皮欠損モデルを作製した。創閉鎖まで6時間おきにフルオレスセインで染色し、角膜上皮欠損の治癒過程を実体顕微鏡で撮影し欠損残存面積を統計学的に比較検討した。また各ステージごとに 眼球を摘出し、パラフィン切片を作成後、組織学的、免疫組織学的に比較検討した。(2) 同モデルで経時的に屠殺後摘出したWTとKOマウスの角膜をTUJ1で免疫染色し、フラットマウント標本で蛍光顕微鏡下で観察し、角膜知覚神経の形態と再生の程度を比較検討した。(3)WTとKOマウスを使用しコシェボネ角膜知覚計を用いて角膜知覚を計測し比較検討した。【結果】(1)KOマウスではWTマウスと比較し角膜上皮欠損の閉鎖が12時間後、18時間後、24時間後で有意に著明に遅延した。テネイシンXは創傷なしではWTマウスの角膜中央部にほとんど発現していないが、角膜上皮欠損作製後に24時間後をピークとして角膜上皮基底部を中心に発現が増強した。HE染色ではWTでは著名な炎症細胞の浸潤をみとめたが、KOでは炎症細胞の浸潤が抑制されていた。phospho p38、MPO、IL-6はKOで角膜上皮基底部の発現が抑制されていた。F4/80はWTとKOで差はみられなかった。(2)創傷なしの角膜中央部ではWT、KO共に知覚神経が密に存在していることが確認されWTとKOで差はみられなかった。24時間後の上皮再生部分においてはWTとKOで明らかな差はみられなかった。(3)KOで角膜知覚は有意に低下していた。【結論】TNXは角膜上皮治癒に必要である。TNXの角膜知覚神経構築への関与は免疫染色では確認されなかった。当初の予定通り、TNX欠失マウスが生まれ次第順次実験を遂行している。今後、TNX欠失マウスの繁殖が順調に行けば、n数を必要とするreal time RT-PCRでの定量的な比較検討に以降できる。また TRPファミリーとの関連も順次調査する予定である

  • 拡張したランダムペプチド集団から効率的に薬物リードを取得する方法の開発

    研究期間:

    2020年07月
    -
    2022年03月
     

     概要を見る

    本研究では、ヘテロキラルなランダムライブラリから生物活性ペプチドを取得する方法を確立する。ビーズ当たり2^n種のジアステレオマーを提示できるone-bead-2^n-peptideライブラリから、標的タンパク質と結合するアミノ酸配列を決定した後、マルチペプチド合成を用いて結合活性を示すジアステレオマーを同定する。ここでは標的を抗体医薬に絞り、そのmimotopeを取得するプロトコルを確立する。特に、1ビーズ上にあるペプチド総量の1/2^nしかない単一のジアステレオマーへの結合を検出するために、Rolling Circle Amplificationを用いたシグナル増幅による高感度化を図る

  • 人工コラーゲン様ポリペプチドを用いた黄斑円孔治療用デバイス開発

    日本医療研究開発機構(AMED)  橋渡し研究戦略的推進プログラム・シーズB

    研究期間:

    2018年
    -
    2021年
     

  • コラーゲンを標的とするRNAアプタマーの取得と創薬への試み

    研究期間:

    2017年06月
    -
    2019年03月
     

     概要を見る

    コラーゲン3重らせん上のアミノ酸配列は、複数のタンパク質と特異的に相互作用することで、血液凝固などの病態に直結する多彩な生理機能を発揮する。本研究は、巨大なコラーゲンを標的として一度に複数のRNAアプタマークローンを取得し、個別のクローンの性質を解析することを目的とした。それぞれのアプタマーは、認識する3重らせん上の配列(エピトープ)により、それぞれ異なる機能を発揮し、異なる用途に供せられるものと期待される。選択の結果、いくつかのクローンを取得することに成功した。現在、SPR、EMSA等の分子間相互作用に基づく測定法の改良を行い、得られたクローンのコラーゲンに対する結合を解析中である。創薬標的として魅力的な生理機能を持つコラーゲンであるが、コラーゲン分子の大部分を占める3重らせんドメインに対する、抗体の作製が困難であるがゆえに、アプローチすることができなかった。本研究は、SELEXの利点を最大限活用して、新しい創薬ターゲットとしてのコラーゲンの有用性を示そうとした。様々な選択方法を組み合わせてRNAアプタマーの取得条件を最適化することにより、いくつかのクローンを得ることができた。今後、コラーゲンに対する詳細な結合様式の解析により、生体機能の維持に深く関わっているコラーゲンの機能解析の一端を担うとともに、中分子医薬品として、治療薬、診断薬への応用が期待される

  • 生体内コラーゲンの分子状態の可視化と医療への応用を目指した新規環状ペプチドの開発

    研究期間:

    2017年06月
    -
    2019年03月
     

     概要を見る

    コラーゲンは3重らせん構造をもつ。がんの周辺などでは、その3重らせん構造が変性したコラーゲンが存在すると考えられているが、それを検出できる有効なプローブは無かった。本研究では、緩んだ3重らせんにハイブリッド形成する既報ペプチドの設計を基にして、さらに高感度に変性コラーゲンを検出できるペプチドを開発した。このペプチドは、コラーゲン様ペプチドの環化2量体である。本物質は、既報の1本鎖ペプチドに比べて約百倍強い親和性で変性コラーゲンに結合した。この環状ペプチドがin vitroでコラーゲンの高感度な検出に利用できることを示した。さらに、蛍光標識したペプチドを用いて、マウスに移植したがんを可視化した。がん、骨・軟骨疾患、線維化、炎症性疾患などでコラーゲン3重らせんが変性していることが予想されており、それを検出するプローブの開発が求められていた。これまでに1本鎖のコラーゲン様ペプチドがこの目的で試されてきたが、本研究においては、分子設計の改変により約2オーダーの結合能の改善を達成できた。これにより、培養細胞レベルから生体のイメージングに至る広範囲な実験系において、緩んだ3重らせんを検出、定量、可視化することが可能となった。この成果は、基礎研究から診断薬・治療薬開発を目指した応用研究まで幅広い研究領域にひとつの新たなツールを付け加えた

  • コラーゲンを標的とするRNAアプタマーの取得と創薬への試み

    科学研究費助成事業(早稲田大学)  科学研究費助成事業(挑戦的萌芽研究)

    研究期間:

    2017年06月
    -
    2019年03月
     

  • 生体内コラーゲンの分子状態の可視化と医療への応用を目指した新規環状ペプチドの開発

    科学研究費助成事業(早稲田大学)  科学研究費助成事業(挑戦的萌芽研究)

    研究期間:

    2017年06月
    -
    2019年03月
     

  • ボツリヌス毒素の疼痛抑制効果の分子基盤解明と応用的研究

    科学研究費助成事業(早稲田大学)  科学研究費助成事業(基盤研究(C))

    研究期間:

    2014年04月
    -
    2017年03月
     

     概要を見る

    ボツリヌス毒素(BoNT)の疼痛抑制効果の分子機構を解析するために、BoNTの活性測定系の開発と蛍光標識全長BoNTの作製を行った。また、4種の抗SNAP-25ペプチド抗体を作製して、三叉神経節培養細胞においてBoNT/AまたはBoNT/Eの投与によりSNAP-25が切断されることを示した。このことから、神経障害性疼痛に対するBoNTの疼痛抑制効果は、末梢に投与されたBoNTが知覚神経節でSNAREタンパク質を切断して神経伝達物質の遊離を減少させることにより得られることが示唆された

  • ボツリヌス毒素の疼痛抑制効果の分子基盤解明と応用的研究

    科学研究費助成事業(早稲田大学)  科学研究費助成事業(基盤研究(C))

    研究期間:

    2014年04月
    -
    2017年03月
     

  • HSP47を標的とするペプチド性抗線維化薬の開発

    研究期間:

    2013年04月
    -
    2016年03月
     

     概要を見る

    小胞体に局在するコラーゲン特異的分子シャペロンHSP47は、線維化疾患においてコラーゲンの過剰な産生に貢献している。研究代表者らは、HSP47を阻害するコラーゲン様3重らせんペプチドを細胞に取り込ませ、小胞体に蓄積させることができれば、線維化疾患の治療に役立つと考えた。本研究により、in vitroで当該ペプチドを細胞内に導入することには成功したが、逆行輸送をたどって小胞体に送達させることはできなかった

  • コラーゲン分子上の特異な配列を認識するアプタマーの取得と再生医学への応用

    京都大学再生医科学研究所  共同研究課題

    研究期間:

    2016年
    -
     
     

  • 体細胞からの高機能性分子の単離・同定

    科学技術振興機構  マッチングプランナープログラム「探索試験」

    研究期間:

    2015年
    -
    2016年
     

  • シスプラチン誘導体の線維化疾患治療薬としてのポテンシャル

    研究期間:

    2012年04月
    -
    2013年03月
     

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    本研究では、in vitroでのランダム探索から見出されたシスプラチン誘導体の、コラーゲン細線維化阻害活性の分子機構を解析するとともに、その線維化疾患治療薬としての応用可能性を追求した。活性本体であると考えられるシスプラチン-DMSO錯体は、コラーゲン3重らせん上のHisあるいはMet残基を標的として結合していることが示唆された。また、この錯体は、in vitro細胞培養系においても分泌されたコラーゲン線維の沈着を阻害した

  • 物質輸送を精密に制御できる高分子ブラシ自己集積化多孔性膜の設計と合成

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    ポリアクリル酸の側鎖に種々の割合でシステアミンを結合したチオール含有高分子電解質を合成した。この修飾ポリアクリル酸を金を被覆した膜の上に自己集積化した。自己集積化の程度は表面プラズモン共鳴法により測定した。まずポリアクリル酸にチオール基を導入することでポリアクリル酸が自己集積化できることがわかった。また、修飾ポリアクリル酸水溶液濃度が高くなるほど、自己集積化量が増加し、ある濃度以上では一定になることがわかった。そして、この飽和集積化量は、チオール含有量の少ない修飾ポリアクリル酸ほど高いことがわかった。これは、チオール含有量が少ないほど金表面との結合点が少なく、そのため集積化の際の表面占有面積が少なくなりより多くの修飾ポリアクリル酸を集積化できるためのと考えられた。また、集積化量は、水溶液のpHやイオン強度にも依存した。低pHで集積化した場合には、集積化の際に高分子電解質が収縮しているために、占有面積が少なく、より多くの高分子電解質を集積化できた。次ぎに、このような集積化を多孔性膜上で行い、膜のpHに応答した物質透過性を調べた。低pHでは、ポリアクリル酸がプロトン化され、収縮して、孔を広げ、水透過性が高くなったが、中性pHでは、イオン化され、鎖が伸展して孔を塞ぎ、水透過性を減少させた。この刺激応答性は、集積化膜によって相違が見られた。集積化度が非常に低い場合には、殆どこの刺激応答性は観測されなかった。一方、集積量が多くなりすぎると、表面での高分子の動きが制限され、刺激応答性は減少した。中程度の集積量で最も高い刺激応答性が観測された。このように集積度の調整により水透過の刺激応答性を制御することができた。また、DNAやポリエチレングリコールの透過性についても検討した

  • 遺伝子導入による細胞設計と生体分子固定化による材料設計を総合した細胞培養系の構築

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    1)遺伝子導入による細胞設計:エリスロポエチンの産生のためにチャイニーズ・ハムスター卵母(CHO)細胞にエリスロポエチン産生遺伝子を導入した上で、さらに固定化上皮成長因子(EGF)の効果を増幅するためにEGFレセプター遺伝子も導入した。二種類の遺伝子が導入されたことを確認した後、細胞培養を行ったところ、EGF固定化材料上で顕著な増殖速度が観測された。増殖速度の加速に伴い、エリスロポエチンの産生量も増加した。この関係は、線形で、特に相乗的な効果は見られなかったが、固定化EGF特有の増殖促進効果が観測され、有用性が示された。2)生体分子固定化による材料設計:光反応性のEGF、ヘパリン、温度応答性構文氏を調製し、ポリスチレン基板上に塗布した後、数マイクロメートル幅のストライプの光透過領域の間隔を傾斜的に変化させた光マスクをのせ、紫外線を照射し、表面に傾斜パターンを形成させた。この基板上で細胞培養を行い、傾斜パターンに従った細胞の挙動を観測できた。3)生体分子固定化材料の新しい可能性:溶解状態EGFは副腎髄質褐色細胞腫由来PC12細胞の成長を促進するだけであるが、EGF固定化材料はPC12細胞の分化を促進することが明らかとなった。一般には神経成長因子(NGF)がPC12細胞を分化に誘導することが知られているが、固定化EGFは、それと同じ効果をもつようになった。これまでにEGFは、細胞内情報伝達タンパク質を短期間しか活性化しないのに対し、NGFは細胞内情報伝達タンパク質を長期間に亘り活性化することが知られている。以前の研究より、EGFは固定化により細胞内へ取り込まれにくくなり、長期間に亘り、細胞内情報伝達タンパク質を活性化することを明らかにしており、成長・分化のスイッチングは、この情報伝達タンパク質活性化時間の長短であると考えられた

  • ペプチドモデルを用いた構成的アプローチによるコラーゲンの3本らせん形成過程の解明

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    1.2,2'-bipyridine含有コラーゲンモデルによるコラーゲン3本らせん検出法の改良末端にbipyridyl基を有するコラーゲンモデルペプチドを、種々の遷移金属イオンの存在下において錯形成させ、その分光学的性質を検討した。その結果、従来用いていた二価鉄イオンがコラーゲンヘリックスの検出には最も適していることがわかった。また、bipyridyl基をコラーゲンモデルペプチド鎖の内部に組み込めるようにするため、アミノ基およびカルボキシル基両方を有するbipyridine誘導体を新規に合成した。2.HSP47およびプロリン4-水酸化酵素のシャペロン機能の解明プロコラーゲン特異的シャペロンHSP47が3本らせんを形成したX-Arg-Gly配列を特異的に認識するという知見に基づいて、種々のアルギニンおよびプロリン誘導体を含有するコラーゲンモデルペプチドを合成し、HSP47との相互作用を解析した。その結果、HSP47との結合には側鎖グアニジノ基が重要であることが明らかになった。また、構築した1本鎖型ペプチドライブラリーを用いた網羅的解析により、プロリン4-水酸化酵素タイプIとタイプIIの基質結合プロファイルがほぼ同じであることが明らかになった。この結果は、いずれのタイプのプロリン4-水酸化酵素も1本鎖のコラーゲンに結合する分子シャペロンとして機能していることを意味する。本研究から得られた知見は、小胞体内におけるプロコラーゲンのフォールディング過程で、プロリン4-水酸化酵素からHSP47へとプロコラーゲンが受け渡たされることを示唆している

  • HSP47のプロコラーゲンに対するシャペロン機能の分子基盤

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    本研究では、プロコラーゲン特異的分子シャペロンHSP47の分子機能を明らかにする目的で、コラーゲンモデルペプチドとHSP47との相互作用をin vitroで解析した。1.HSP47のオリゴマー構造についてリコンビナントHSP47を基質となるコラーゲンモデルペプチドの存在下および非存在下においてグルタルアルデヒド処理することにより、そのオリゴマー形成を検討した。しかし、これまでにHSP47が多量体を形成していることを積極的に支持するデータは得られていない。2.ホモおよびヘテロ3量体型コラーゲンモデルペプチドの合成とそのHSP47結合性HSP47結合配列であるPro-Arg-Glyをトリプルヘリックス当たり0〜3個含む4種の3量体型コラーゲンモデルペプチドを合成した。3量体化には位置選択的ジスルフィド結合形成反応を利用した。合成したホモおよびヘテロ3本鎖とHSP47との結合実験の結果から、トリプルヘリックス上の1つのアルギニン残基がHSP47との特異的な結合に十分な構造情報を有していることが明らかになった。3.HSP47上のコラーゲン結合部位の同定光反応性活性基をもつ4-benzoylphenylalanineを導入したコラーゲンモデルペプチドを用いて、HSP47との光架橋を行った。これまでに、最適架橋条件が決定され、また、架橋体の精製にも成功している。精製した架橋体の酵素による断片化および断片の配列解析によるHSP47の基質結合部位の同定は今後の課題である

  • 体温では折り畳み不能なコラーゲンの生合成を実現する小胞体シャペロンシステム

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    1.光架橋性官能基を有するコラーゲンモデルペプチドを用いたprotein-footprintによるHSP47のコラーゲン認識機構の解析光架橋性アミノ酸残基(Bpa)を導入したコラーゲンモデルペプチドと精製したHSP47とを混合し、紫外線照射によりクロスリンクした。クロスリンク体の酵素消化断片の構造解析により、HSP47タンパク質上のコラーゲン結合部位をある程度絞り込むことができた。すなわち、HSP47のコラーゲン結合部位は、HSP47にひとつ存在するシステイン残基とは反対側の側面に位置することがわかった。また、3個のBpa残基を導入した3量体型コラーゲンモデルペプチドとHSP47とのクロスリンク実験の結果から、複数のHSP47分子が細いコラーゲントリプルヘリックスを取り囲むように結合するという、新たな複合体モデルが導かれた。2.HSP47のシャペロン機能を証明する検出システムの開発HSP47がコラーゲントリプルヘリックス構造の形成を直接促進するシャペロンであるか否かを検証するためには、HSP47共存下においてトリプルヘリックス形成をモニタできるin vitoのシステムを開発する必要がある。本研究では、末端に2個のシステイン残基を有するコラーゲンモデルペプチドが、トリプルヘリックス形成に依存して、空気酸化によりジスルフィド架橋されることを見出した。ジスルフィド架橋されたペプチドは逆相HPLCを用いて容易に分離・定量できるため、HSP47のシャペロン機能の解明に応用可能である

  • 細菌性コラゲナーゼによる宿主細胞外マトリックスの分子認識にかかる学際的研究

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    Clostridium属細菌のコラゲナーゼ(CloCols)のC末端には、細胞外マトリックスの主成分である不溶性コラーゲンに結合するためのドメイン(CBD)が存在する。昨年度の本研究により、遺伝子進化の過程でCBD領域の複製・欠失が繰り返されたことが明らかとなった。CBDの起源を探るため、生命情報科学的検索を行ったところ、Proteobacteria由来の金属プロテアーゼCloColsと同様のドメイン構成を見いだした。そのC末端に存在するPPCドメインはCBDと構造的に類似していたが、CBDに共通に存在するN末端リンカーと基質結合性残基を欠いていた。PPCと共通の起源を有する単純なドメインがコラーゲン結合に必要な構造を獲得し、CBDに進化したと考えられた。(平成18年3月3日J Bacteriol誌に投稿)N末端側リンカーによるCBDとCa^<2+>の結合を等温滴定型熱量計を用いて解析したところ、CBD 1molあたりCa^<2+> 2molの結合が見られた。解離定数は2.13μMおよび4.63μMであり、細胞内外のCa^<2+>濃度の中間であった。Ca^<2+>の有無とドメインの安定性を熱変性により検討したところ、Ca^<2+>非存在時は48℃で変性が始まったが、Ca^<2+>存在下ではドメイン構造は82℃まで安定であった。CloColsが細胞外に分泌された後、CBDはN末端リンカーによりCa^<2+>を結合してドメインを安定化することが確認できた。種々の二価カチオンの存在下でCBDの結晶化を試みたところ、Co^<2+>の存在下でN末端側リンカーが新たなコンフォメーションをとることが見いだされた。(投稿準備中)水溶液中でのコンフォメーション変換過程を詳細に検討するため、^<15>N,^<13>C標識したCBDを作製してNMR解析を進めており、現在主鎖の約70%のシグナルの帰属が完了したところである

  • 線維化疾患治療薬を目指した分子シャペロン阻害剤の創製

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    1.HSP47阻害剤デザインのためのペプチドシード化合物の最適化HSP47が認識するコラーゲン3重らせん上の2つのアミノ酸残基に関して、前年度までに得られていた情報を基にして、徹底した構造活性相関データを収集した。すなわち、HSP47が認識するArg残基(第一ファーマコフォア残基)およびそのArgの3残基N-末端側にあるアミノ酸(Yaa-3:第二ファーマコフォア残基)について、非天然アミノ酸を含むシステマティックな置換を施した40種類以上のコラーゲン様ペプチドを化学合成した。それらのペプチドとHSP47との結合アフィニティーをin vitroで定量的に評価し、HSP47上に存在する「コラーゲン認識ポケット」の性状についての情報を得た。その結果、第一ファーマコフォア残基に最適なアミノ酸はArgであり、とくに側鎖グアニジノ基の存在が必須であることが明らかになった。また、第二ファーマコフォア残基に最適なアミノ酸はThrであった。2.HSP47とコラーゲンとの結合を阻害する小分子化合物のスクリーニングについてHSP47がin vitroでのコラーゲンの線維形成を阻害することを利用した、マルチウェルプレート対応のスクリーニングシステムを構築した。上記1で使用したペプチド性阻害剤を用いてこのスクリーニングシステムのバリデーションを行った。その結果、今回構築したシステムは従来我々が用いてきたpull-downアッセイや、BIAcoreをもちいた競合結合実験と同等の精度・感度を有することが確認され、薬物のスクリーニングに使用可能であると判断できた

  • HSP47はいかにしてコラーゲンの構造形成を助けているのか

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    HSP47はプロコラーゲンの生合成に重要な分子シャペロンである。HSP47は臓器の線維化において正の調節因子として働いていることが明らかであるため、肝硬変や肺線維症に対する治療薬開発のための分子ターゲットとしでも注目されている。我々は、HSP47が正しくフォールディングしたのちのコラーゲン3重らせんを認識することを明らかにした。このような性質は、シャペロンがunfolded/misfolded蛋白質を認識して結合するという一般的な概念とは異なるものである。我々は、HSP47が、熱的に不安定なプロコラーゲンの3重らせん部分のスタビライザーとして機能するという仮説を提唱している。しかし、ケミカルシャペロンやモデルペプチドの利用など、様々な実験系を用いてこの仮説の検証をこころみているもののいまだに確定的な結論は得られていない。一方、HSP47のコラーゲン認識機構の解析は進展した。コラーゲンモデルペプチドを主に利用した解析手法をもちいて、HSP47が認識する結合モチーフを同定した。すなわち、HSP47は同一ポリペプチド上に存在する2つのアミノ酸残基を認識して結合し、その高アフィニティー結合モチーフは{-Gly-X-(Thr/Pro)-Gly-X-Arg-}と記述できることが明らかになった。結合モチーフが一次構造で記述可能であることがわかったので、ゲノムデータベースからHSP47のクライアントとなるタンパク質を予測・抽出する検索プログラムを構築し、検索を実施した。その結果、コラーゲンファミリー蛋白質の中には、HSP47結合モチーフを持たないものも存在することが明らかになった。このような情報は、HSP47のシャペロン機能の解明に役立つだけでなく、クライアント特異的な分子シャペロンとそのクライアント蛋白質との共進化を考察する上でも興味深いものである

  • 創薬を目指したコラーゲンのケミカルバイオロジー

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    コラーゲン結合性をもつ種々の生理活性タンパク質に対する阻害剤を取得するためのhigh-throughput screening系を確立した。この系を用いて、シャペロンHSP47、血液凝固に関わるGlycoprotein VI(GPVI)、von Willebrand因子(VWF)、血管新生阻害活性をもつ色素上皮由来因子(PEDF)、クロストリジウム菌コラゲナーゼに対する阻害剤候補化合物を得た。PEDFに結合性を示したペプチドの構造-活性相関研究から、PEDFの血管新生阻害活性の発現におけるへパラン硫酸プロテオグリカンの関与が示唆された

  • コラーゲン3本らせんとシャペロンHSP47との共進化の可能性

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    コラーゲンは全ての多細胞動物に存在しているが、その分子シャペロンHSP47はほ乳類などの脊椎動物以上の高等動物にしか見られない。コラーゲン3本らせんは、その進化過程で、分子シャペロンであるHSP47を獲得することにより、体温では不安定な長いプロコラーゲン分子を産生できるようになったと考えられる。本研究では、この可能性を明らかにするツールとして、分子シャペロンHSP47の発現を自由にコントロールすることが可能な「シャペロンスイッチ付き細胞」を作成した

  • 細菌性コラゲナーゼの基質結合ドメインを用いた薬物送達システムの開発型研究

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    「人喰いバクテリア」が産生するコラーゲン分解酵素は、コラーゲン細線維に結合する領域(CBD)をもつ。まずCBDの中で結合に直接関与する部位を明らかにした。次にCBDはコラーゲン分子の三重らせん構造が緩んだ部位を志向して一定の向きに結合することを示した。さらに、CBDの接続部はカルシウムを結合して構造が変わり、CBDの安定性と結合能が向上することを示した。最後に、CBDを用いて種々の生理活性物質を組織に結合させる新規の技術が種々の再生医療に応用できることを示した

  • コラーゲン様3重らせんペプチドの動態特性を利用した新規ドラッグキャリアの開発

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    化学合成した3重らせんペプチドの、マウスあるいはラットにおける体内動態を解析した。その結果、3重らせん構造がプロテアーゼによる分解に強く抵抗することが分かった。また、コラーゲン様3重らせんペプチドは、未変化体として高い尿排泄性を示した。これらのことから、コラーゲン様3重らせんペプチドが、新しいタイプのドラッグデリバリーシステム(DDS)用キャリアー分子として応用可能であることが示唆された

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学内研究費(特定課題)

  • DDS担体としての環状コラーゲン様ペプチドの最適化

    2021年   永渕寛子

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    CMPのN末端結束法として以下を検討した。i)オレフィンメタセシスによる炭素-炭素結合形成、ii)N末端アミノ酸残基同士でのジケトピペラジン形成、iii)ジカルボン酸によるアミド形成。これらのうち、i)およびii)では、目的物(cCMP)の収率は極めて低かった。最も良好な収率で目的物が得られたのはiii)のジカルボン酸による結束であった。次いで、ジカルボン酸架橋型cCMPのペプチド鎖長を変化させたものを合成し、それらの変性コラーゲン結合能を調べた。その結果、同じ鎖長のジスルフィド架橋型(従来型)cCMPと比較すると、結合能はやや低下する傾向が認められた。さらに、N末端に導入したGlu残基のジカルボン酸を用いて環化したcCMP(Glu)を調製し、これと生物活性ペプチドとのコンジュゲート化にも成功した。

  • 3重らせん型ランダムペプチドライブラリからの生物活性ペプチドの探索

    2020年   増田 亮

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    コラーゲンは特徴的な3重らせん構造を有し、その3重らせん構造上に提示された特異なアミノ酸配列をタンパク質などの生体高分子が認識し、結合することで細胞の接着や分化といったさまざまな生物機能を発揮・制御している。我々はランダム領域を含むようにデザインした3重らせんペプチドライブラリを酵母内に構築し、そのなかからtwo-hybridアッセイによって標的タンパク質と結合するペプチドを選択することとした。標的として血管新生阻害タンパク質である色素上皮由来因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)を用い、スクリーニングを行った結果、天然のコラーゲンには存在しない新規な3重らせんペプチド配列を複数取得した。

  • 血栓形成を抑制する人工コラーゲンコーティング剤の開発

    2019年   市瀬慎一郎

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    我々はこれまでに、天然コラーゲンがもつ機能性アミノ酸配列を組み込むことで、特定の生物活性を付与できる人工コラーゲン様マテリアルを開発してきた。これを利用すれば、血液凝固を促進あるいは阻害するバイオマテリアルを作ることができると期待できる。今回我々は、種々のアミノ酸配列を別個に組み込んだ人工コラーゲンを作製し、それに対する血小板の接着・凝集を調べ、どの配列が血液凝固に大きく寄与しているのかを調べた。その結果、インテグリンやディスコイジンドメイン受容体、シンデカンに結合する配列に対し、血小板の結合が見られた。加えて、人工コラーゲンそのものがglycoprotein VIのリガンドとして働き、凝集を促進している可能性が示唆された。

  • 生体内コラーゲンの分子状態の可視化と医療への応用を目指した新規環状ペプチドの開発

    2019年   金井沙也伽

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    我々が開発した環状コラーゲン様ペプチド(cCMP)は、コラーゲン3重らせんの緩んだ部分にハイブリッド形成することにより、それを検出できるプローブである。しかし、保存中にcCMP同士がオリゴマー化し、変性コラーゲンへの結合能を失うことが問題であった。今回我々は、cCMPを構成するペプチド鎖内に、O-アシルイソペプチドを導入したものを設計・合成した。このO-アシルイソペプチド型cCMPは、酸性水溶液中では安定に存在したが、pHを7.4に変化させることで、O→Nアシル転移反応によりアミド型cCMPに変換され、変性コラーゲン結合能を獲得した。今回開発したcCMP前駆体は、変性コラーゲンを標的とした新規セラノスティクスのプロドラッグとして有望である。

  • コラーゲン3重らせんの自律的な熱適応機構へのシャペロンの介入による分子進化の促進

    2018年   増田亮, 藤井一徳

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    一般にタンパク質は、一次構造すなわち、遺伝的に規定された構造熱安定性を有しているとされる。しかし、コラーゲン3重らせん構造の熱安定性においては、プロリンの4位水酸化を主とする高度な翻訳後修飾による寄与が大きく、その分子メカニズムから、自律的フィードバック機構をもつ修飾量の調節によって熱安定性のチューニングがなされていることが推定される。本研究では、魚類から樹立された線維芽細胞株を様々な温度で培養し、分泌されたコラーゲンを分析した。その結果、コラーゲン3重らせんの熱安定性は環境温度に応じてチューンされうることが示された。

  • 緩んだコラーゲンを特異的に検出できるペプチドの構造最適化

    2018年   瀧田講

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    コラーゲンの3重らせんが緩んだ部分にハイブリッド形成して結合するペプチド(cCMP)の構造最適化研究を実施した。従来型cCMPはペプチド同士での3重らせん形成に伴い自己集合する性質があったため、使用直前に加熱変性する必要があり、これが実用化における問題であった。本研究では、cCMPを構成するペプチド鎖への電荷の導入および主鎖構造への歪の導入により、この問題を解決しようとした。多数作成した改変分子の中から、コラーゲンへのハイブリッド能を維持しつつ、自己集合能が低減された分子が得られた。この最適化cCMPを用いて、in vitroで変性コラーゲンを検出できた。また、その感度は、抗コラーゲン抗体のそれに匹敵した。

  • 新規ペプチド性タグ創出のためのヘテロキラルランダムペプチドライブラリの構築と利用

    2018年   増田亮, 宇田川雛子

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    ランダムペプチドライブラリは、モノクローナル抗体(mAb)に対するepitopeの同定あるいはepitopeを模倣するmimotopeの取得に有用である。これまでにファージディスプレイ系によるランダムペプチドライブラリからmAbに対する数々のepitope/momotopeが取得されてきた。本研究では、探索可能なケミカルスペースを拡張するために、L、D-アミノ酸が混在したヘテロキラルなペプチドをも探索範囲に含めたランダムライブラリからのスクリーニングシステムを開発した。本ペプチドライブラリは従来のsplit-and-mix法を応用して構築した。この中から抗エンドルフィンmAbに対するヘテロキラルなmimotopeを複数取得できた。その中には、μ-オピオイド受容体特異的なリガンドとして働く新規ペプチドも見つかった。

  • 3重らせんペプチドスキャフォールドを利用した中分子創薬

    2016年   増田亮

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    コラーゲン様3重らせん構造は剛直な構造であり、生体内で優れた安定性を示す。本研究は、あらたな中分子創薬のためのプラットフォーム技術として、3重らせん構造を有するランダムペプチドライブラリの構築と、標的タンパク質との結合評価によるスクリーニング系を開発することを目的とした。ここでは、ライブラリの多様性確保と、スクリーニング系のルーチン化の容易さの観点から、酵母2-ハイブリッド系を用いたシステムを構築することとした。まず、既知のコラーゲン結合タンパク質と3重らせんペプチドのペアをもちいた、酵母2-ハイブリッド系で特異的な相互作用が検出できることを確認した。現在ペプチドライブラリの構築を進めている。

  • 人工コラーゲン様マトリックスを用いた細胞組織構造構築原理の解明

    2016年  

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    本研究は、人工コラーゲン様ペプチドポリマーを利用して、天然コラーゲンが細胞に入力している様々なシグナルを個別に解析し、さらにそれらの伝達系の間にある相互作用(相互干渉)について明らかにすることを目的として実施した。ここで用いる人工コラーゲンは、化学合成した3重らせんペプチドを、ジスルフィド架橋によってポリマー化したものである。インテグリン結合配列を導入した人工コラーゲンの上で細胞を培養すると、特異的な細胞接着が観察された。また、ポリマー中のインテグリン結合配列の量を変化させることで、細胞接着の強度を変化させることもできた。この場合、最強の接着活性は、天然コラーゲンのそれよりも高いものであった。

  • 裸の新生鎖を生細胞内に導入する方法の開発

    2015年  

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     本研究では、ペプチド鎖がpost-translationalに細胞質から小胞体に輸送される過程を解析するために、様々に設計したペプチドを「裸の新生鎖」として、生細胞に導入し、その輸送と局在を検出できる実験系の構築を試みた。 まず任意のペプチドを生細胞に導入できるようにするために、cell-penetrating peptide (CPP)をジスルフィド結合により目的のペプチドに結合させた。また、CPP部分および目的ペプチド部分には異なる蛍光基を導入した。上記合成したペプチドを、HeLa細胞に投与し、共焦点顕微鏡で観察した。CPP-ペプチドコンジュゲートは効率よく細胞内に取り込まれた。また、細胞質内でジスルフィド結合は切断されCPPとペプチド部分が解離していることがわかった。

  • コラーゲン3重らせん上の生物活性部位を特異的に認識するRNAアプタマーの取得

    2014年  

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    本研究ではまず血液凝固にかかわるvon Willebrand因子によって認識されるⅢ型コラーゲン上のエピトープ(GPRGQOGVMGFO,Oは4-水酸化プロリン)に対するRNAアプタマーを取得することを目指した。当該配列を含むコラーゲン様3重らせんペプチドを化学合成し、それに結合するRNAをin vitro SELEX (Systematic Evolution ofLigands by EXponential enrichment)法により得ようとした。しかし、サイクル途中で結合分子の増幅ができなくなり、目的のRNAアプタマーの取得には至らなかった。そこで、天然の未変性I型コラーゲンに結合するRNAアプタマー群をまず取得し、その中から有用なものを再度選択する方法に切り替えた。コラーゲン分子に対してSELEXサイクルを繰り返した結果、コラーゲンに対して有意に結合力が上がっているプールを得た。

  • 優れた物性と機能を併せ持つ超分子型コラーゲン様マトリックスの設計

    2013年  

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    本研究では、安全、高機能かつ、フレキシブルに分子デザインの変更が可能な、人工コラーゲン様マトリックスの作成を目指した。化学合成したペプチドの自己集合によってコラーゲン様超分子を作成するにあたっての問題点は以下の3点に大別できる。伸長する長い3重らせん超分子の形成、超分子ハイドロゲルへの優れた物理的強度の付与、および細胞の機能を制御するための機能性アミノ酸配列の導入、である。 すでに我々の研究グループは、コラーゲン様超分子の作成法として、超分子の伸長を伴いながら3重らせんにフォールディングできるコラーゲン様ペプチドのデザインを報告している(Yamazaki, et al. Biopolymers 2008)。しかし、この方法はスケールアップが困難でありコスト的にも見合わないため、①これらの問題を解決しうる別の超分子デザインについて検討した。また、②3重らせんペプチド間でのクロスリンク形成によるハイドロゲル物性の向上についても検討した。①3重らせんペプチドを連結して超分子化させる方法の検討 コラーゲンを構成するアミノ酸配列である(Gly-X-Y)nの末端に反応性官能基を導入したペプチドを化学合成し、低温で3重らせんにフォールディングしたのちに、二あるいは三官能性の低分子リンカーをもちいて3重らせん同士を連結した。このような多官能性リンカーを用いたペプチドの連結では、ゲル化能を持つ超分子は形成されなかった。一方、3重らせんペプチド間の直接的な共有結合形成による連結法においては、ゲル化能を持つ3重らせん型超分子を与える条件を見出した。(知財保護の観点から、詳細については記述しない)②3重らせん間でのクロスリンク法の検討天然のコラーゲン3重らせんは、リボフラビン存在下で紫外線(UVA)照射によりクロスリンクが架かり、ゲルが硬化することが確認された。また、アミノ酸分析からこの反応にはチロシン残基が関与していることが確認された。しかし、リボフラビン+UVAによる反応では、可溶性の3重らせんペプチド同士をクロスリンクし、ゲル化させることはできなかった。

  • コラーゲンの糖化修飾と血管新生とのかかわりに関する分子科学的研究

    2013年  

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    網膜色素上皮由来因子(Pigment epithelium-derived factor, PEDF)は網膜における主要な血管新生阻害因子として働く。また、PEDFはコラーゲン上のアミノ酸配列を特異的に認識して結合する。PEDFが認識するコラーゲン上の配列は、血管新生に関与することが知られている膜結合型ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)結合配列、および高血糖によってadvanced glycation end products(AGEs)が生成する配列とも重複している。そこで本研究では、コラーゲンおよび、該当する領域を含むコラーゲン様3重らせんペプチドを人為的に糖化(AGE)化したものを作成し、それを用いてin vitroでPEDFおよびヘパリン(HSPGアナログ)との相互作用の解析を行うこととした。①遺伝子組換えPEDFの作成 大腸菌をホストとしてマウスPEDFをGST融合蛋白質として発現させた。GSTをプロテアーゼにて切断のち、ベンザミジンビーズにてプロテアーゼを除去した。得られた蛋白質は、コラーゲン結合活性およびヒト臍帯動脈内皮細胞(HUVEC)の遊走にたいして有意な阻害活性を示した。②糖化コラーゲンの作成とその性質コラーゲンを高濃度のグルコースとともに37℃で30日間インキュベートし、継時的にサンプルを回収した。日数経過とともに、SDS-PAGE上でコラーゲンalpha鎖に対応するバンドのシフトが観察された。また、3日経過後のコラーゲンは、in vitroでの細線維形成能をほとんど消失していた。③糖化コラーゲン様ペプチドの作成PEDF結合配列を含む3重らせん型ペプチドを化学合成し、②同様に糖化反応を行った。精製物を逆相HPLCにて単離精製に、MALDI-TOF質量分析にて構造を推定した。生成物の一つとしてカルボキシメチル基による修飾が存在することが分かった。④PEDFおよびヘパリン結合性と糖化修飾との関係上記、②および③にて調製した糖化コラーゲンおよびペプチドと、PEDFおよびヘパリンとの結合性をin vitroで調べた。総じて、糖化修飾は両者との結合に対して負に働く傾向がみられた。

  • コラーゲン様3重らせんペプチドの特異な動態特性を生かした薬物の開発研究

    2012年  

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    本研究は、コラーゲン様3重らせん構造をもつ合成ペプチドを、新しいDrug Delivery System (DDS)用キャリアー、あるいは薬物そのものとして利用することを目指して行われた。平成22~23年度に実施した科学研究費補助金挑戦的萌芽研究において、申請者らは経静脈的に投与したコラーゲン様3重らせんペプチドが、血中での高い安定性、血液指向性と尿排泄性を示すことを見出した。本研究では、①3重らせんペプチドの動態特性を決定づける構造パラメータの解明、および②血液指向性と尿排泄性を利用することにより、新しい薬物として応用できる可能性について検討した。①3重らせんペプチドの動態特性を決定づけるパラメータの解明 長さの異なる様々なコラーゲン様3重らせんペプチドの尿排泄性を調べた。その結果、(Gly-X-Y)n配列のnが12以上になると、尿排泄性は若干の低下を示し、血流への滞留性が高くなった。また、nが10のとき、3重らせんペプチドの定量的な尿排泄性は、分子の総電荷が+9~-3の間でほとんど変化がなかった。このことから、3重らせんペプチドの高い尿排泄性は、分子サイズにより影響を受けるが、イオン性の影響はほとんどないことが分かった。さらに、これら3重らせんペプチドの低い臓器移行性と高い血液指向性・尿排泄性は、マウスをもちいたin vivoライブ蛍光イメージングによっても確認された。②血液指向性と尿排泄性を生かした新しい薬物としての応用可能性i)薬物と3重らせんペプチドとのコンジュゲート化による薬物動態の改変ニトロキシドラジカルを持つスピンプローブであるProxylをモデル薬物として、コラーゲン様3重らせんペプチドとのコンジュゲート化によるin vivo動態特性の改変を試みた。マウスを用いた動態解析の結果、経静脈的に投与した低分子量親化合物3-carbamoyl-Proxylは、速やかに臓器に分布し、ほとんど尿排泄されなかった。一方、Proxylを3重らせんペプチドとコンジュゲート化したものは、ほぼ定量的に尿中に排泄された。このことから、コラーゲン様ペプチドとのコンジュゲート化は低分子量薬物の動態特性を改変するために利用できることが示された。ii) in vivoで酸化ストレスを検知する検査薬への応用上記i)で合成したProxyl-ペプチドコンジュゲートを、全身の酸化ストレスをモニタするためのプローブとして利用した。尿中に排泄されたProxylのニトロキシドラジカルは、尿の電子スピン共鳴(ESR)測定により定量できる。健常マウスと酸化ストレスマウスにProxyl-ペプチドコンジュゲートを投与し、採取した尿のESRを測定すると酸化ストレスマウスでは有意にESRシグナルの相対的減少が見られた。

  • 線維化疾患治療薬開発を目指したHSP47阻害剤の探索研究

    2012年  

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    本研究は、コラーゲンの生合成に必須な役割を担っている小胞体局在型分子シャペロンHSP47に対する阻害剤を取得することを目的として実施された。HSP47とコラーゲンとの特異的な相互作用を阻害する物質は、過剰なコラーゲンの合成と組織への沈着が直接の原因である各種臓器・組織の線維化疾患に対する治療薬を開発する上での、リード化合物として利用される可能性を持つ。本研究では、①オリジナルに開発したin vitro高スループットスクリーニング系をもちいたこれまでの探索から得られた化合物Xの活性本体の同定を試みるとともに、②ランダムな化合物スクリーニングを引き続き実施した。①化合物Xの同定 以前の探索により得られたヒット検体Xに含まれる、構造未知の活性化合物について合成、分離、同定を試みた。我々はヒット検体Xの登録構造であるトリペプチド誘導体を再合成し、副生成物や夾雑物も含めHSP47に対する阻害活性を調べたが、オリジナル検体において検出された活性は再現されなかった。また、合成したトリペプチド誘導体を、酸、塩基、光、熱等で処理した検体についてもHSP47阻害活性を検討したが、期待する活性は検出されなかった。現状では、これ以上打つ手はなく、活性本体の構造決定は迷宮入りした。しかしながら、オリジナルなヒット検体X中には明らかなHSP47-コラーゲン結合阻害活性があることから、低分子量HSP47阻害剤は「存在」することが強く示唆された。②ランダムスクリーニング引き続き9440検体のランダムスクリーニングを実施した。その結果、一次ヒット候補化合物として51検体が得られた。そのうち、溶解度と活性の強さを考慮して、二次ヒット候補検体として19化合物を選択した。これら化合物のHSP47への特異性については、他のコラーゲン結合タンパク質である色素上皮由来因子(PEDF)およびクロストリジウムコラゲナーゼS3bをもちいて確認した。しかし現状では、これらヒット化合物の構造に類似性がほとんど見られていない。今後さらにスクリーニングを継続していく予定である。

  • プラチナ錯体を利用したコラーゲン線維化機構の解明

    2011年  

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    本研究は、多数の低分子量化合物からのランダムスクリーニングにより同定されたコラーゲン線維化阻害剤であるシスプラチン-ジメチルスルフォキシド(DMSO)錯体のコラーゲンへの作用を詳細に明らかにすることを目的として実施された。①シスプラチン-DMSO錯体が結合したコラーゲンの超分子構造の観察 シスプラチン-DMSO錯体が結合することにより、正常なコラーゲンの細線維形成が阻害されることは明らかであったが、シスプラチン-DMSO錯体がコラーゲンの超分子形成過程にどのような影響を及ぼしているのかを知るため、走査型電子顕微鏡による観察を行った。その結果、シスプラチン-DMSO錯体存在下では、正常よりもかなり細く枝分かれの多いコラーゲンの超分子構造体が形成されていることが明らかになった。おそらくプラチナ錯体は、枝分かれ部位に局在しているものと推定された。②コラーゲン―シスプラチン錯体複合体のstoichiometryシスプラチン-DMSO錯体のコラーゲンへの結合は、水に対する長時間の透析によってもほとんど解離しないほど強固であることが分かった。また、3重らせん構造を保持した未変性コラーゲンへのシスプラチン-DMSO錯体の結合は、飽和曲線を描いたことから特異的な結合部位の存在が示唆された。このときシスプラチン-DMSO錯体の結合数は、コラーゲン1分子あたり3~4個と見積もられた。さらに、このような錯体のコラーゲンへの特異的な結合は、変性コラーゲンでは観察されなかった。③シスプラチン-DMSO錯体が結合するコラーゲン上のアミノ酸配列の同定さまざまな側鎖官能基を有するアミノ酸を導入したコラーゲン様3重らせんペプチドを多数化学合成し、その中から、コラーゲンの細線維形成に対するシスプラチン-DMSO錯体の抑制効果を打ち消すものを探索した。その結果、HisあるいはMetを有するペプチドのみが選択された。この結果は、シスプラチン-DMSO錯体が結合するコラーゲン上の配列は、HisあるいはMet残基を含んでいることを強く示唆するものである。

  • コラーゲン超分子構造の進化と特異的シャペロンの機能との関わり

    2010年  

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     Heat-shock protein 47 (HSP47)は、脊椎動物では必須のプロコラーゲン特異的分子シャペロンである。HSP47をコードする遺伝子を両アリルで欠損させたノックアウトマウスは、主要なコラーゲンの型についてその生合成が阻害される。このことによって結合組織が脆弱性をしめし、胎生致死の表現型を示す。一方で、コラーゲン3重らせん構造を有する蛋白質はファミリーを形成しており、その生合成過程でHSP47の介在を必要とするもの、必要としないものがあると考えられている。 2006年に小出らは、HSP47に結合するコラーゲン上のモチーフ配列を同定した。このことでHSP47結合性および非結合性のコラーゲン様タンパク質をクラス分けできるようになった。本研究は、正常マウス胎児由来の繊維芽細胞(MEF)およびhsp47 nullマウスから樹立したMEFを蛋白質フォールディングの「容れ物」として利用し、これら細胞に、様々にエンジニアーしたコラーゲン様蛋白質をトランスフェクションし、その外来蛋白質のフォールディング過程をしらべることで、HSP47の分子シャペロンとしての機能とコラーゲン構造との機能的聯関について知ることを目的とした。 本研究期間は、実際の研究データを得る実験を実施するための準備実験に費やされた。正常MEFおよびhsp47 null MEF細胞は、かなりヘテロな細胞集団の様相を呈していたため、プラスティックディッシュ表面への接着性を指標として、いくつかのクローンに分離した。また、細胞の形態、増殖性についてもかなりの差異が認められた。今後これらのクローンについて内因性コラーゲンおよび他の接着分子(ラミニンやフィブロネクチン、プロテオグリカン)の発現を調べ、標準的なクローンを選択後に外来コラーゲンおよびコラーゲン関連タンパク質遺伝子のトランスフェクション実験に入る予定である。

  • 網膜色素上皮由来因子(PEDF)による血管新生阻害の分子機構

    2010年  

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     本研究は、強い血管新生阻害作用を有する内因性蛋白質である色素上皮由来因子(Pigment epithelium-derived factor, PEDF)の作用メカニズムの本質とその構造的基盤、およびPEDFが示す血管阻害活性の調節(あるいは破綻)の機構について明らかにすることを目的として行った。すでに、我々はコラーゲンとPEDFとの結合が血管阻害活性の発現に重要であることを報告している。1)まず、PEDF単独での結晶化条件の探索を行った。第一選択として大腸菌で発現させたリコンビナントPEDFを使用したが、溶解性が悪くX線結晶構造解析に適当な良質の結晶は得られなかった。そこでペプチドとの共結晶化を進めることとした。PEDFは3重らせん型コラーゲン様ペプチドと結合するので、結晶化のスクリーニングを行う室温で3重らせんを形成する最短の長さのコラーゲン様ペプチドをデザイン・合成した。今後、このペプチドとPEDFとの共結晶化を行う。2)PEDFとヘパリン/ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、オーバーラップした特異性をもってコラーゲンに結合することをすでに明らかにしている。今回コラーゲン様ペプチドの構造活性相関研究から、PEDFおよびヘパリンが結合するコラーゲンの配列モチーフを決定した。この情報は、PEDFのみに結合する、あるいはヘパリンのみに結合するコラーゲン様ペプチドを分子デザインによってつくり分けられる可能性を示唆するものであり、細胞をもちいた今後の研究に有効なツールとして用いることができると期待できる。3)PEDFとコラーゲンの相互作用がコラーゲンの分子修飾によって影響をうけるかどうかを、in vitroで糖化修飾したコラーゲンを用いて検討した。その結果、糖化コラーゲンではPEDFとの結合が減弱していた。この結果は、糖尿病による血管増生の新しいメカニズムを示唆しうるものである。

  • コラーゲン3重らせんを模倣した新しいバイオマテリアルの創製

    2009年  

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     本研究は、コラーゲン様3重らせんペプチドをボトム-アップの自己集合によって超分子化することによって、新しいバイオマテリアルを創製することを目的として行った。研究はほぼ順調に推移し、当初計画していた超分子のデザインのひとつをもちいることによって、コラーゲン様3重らせん構造を有するシート状の超分子集積体を作成することに成功した。 具体的には、自己集合によりヘテロ3重らせんを形成する化学合成コラーゲン様ペプチドの両末端にビオチンを導入し、この3重らせんペプチドにアビジンを加えることによって相互にマルチバレントに架橋した。当初は、ゲル状の超分子が生成するものと予想されていたが、意外なことにこの系ではシート状の超分子が得られた。この超分子は、無色透明であり、厚さ5-10 マイクロメートル、面積は平方ミリメートルのオーダーであった。この厚みはロッド状の3重らせんペプチドが縦に約1000ユニットが連結された長さに相当する。また、この超分子の形状や大きさは、ペプチドの分子のデザインによって変化することが明らかになった。 これまでに多くのペプチド超分子が作成されているが、そのほとんどは紐状やゲル状、リボン状のものである。その一方で、水溶液中からシート状の超分子が得られたという報告はほとんどない。したがって、このシート状超分子生成のメカニズムの解明は、あたらしい研究テーマとして今後につながるものとなった。また、興味深いことに、ペプチド、ビオチンの仕込み量比にかかわらず、生成したシートの組成はほぼ一定であった。 さらに、シート表面のビオチンあるいはアビジンの機能を利用して表面の修飾が可能かどうかについて検討した。その結果、アビジン―蛍光色素コンジュゲートをもちいることによって、ビオチンを表面に持つシートの表面にのみ蛍光基を導入することに成功した。 しかし、本シートをバイオマテリアルとして使用するには、物理的な強度が不足していた。今後より安定な構造体を構築するために、クロスリンキング等の工夫が必要である。

  • コラーゲン様三重螺旋型ペプチドの薬物利用への可能性

    2009年  

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    本研究は、化学合成したコラーゲン様3重らせんペプチドの薬物への応用の可能性を探ることを目的とした萌芽的研究である。 コラーゲン様3重らせんペプチドは、コラゲナーゼ以外のプロテアーゼによる消化に抵抗する。また、われわれが行ったラットでのコラーゲン様3重らせんペプチドの体内動態調査では、低い組織移行性によって長時間血液とともに循環するという興味深い予備的結果が得られていた。そこで本研究では、この血液滞留性に着目し、1)血管造影剤、2)抗血小板薬、への利用可能性について検討した。1)血管造影剤への応用 典型的なコラーゲン様ペプチドである(Pro-Hyp-Gly)10のアミノ末端に、核磁気共鳴イメージング(MRI)増感剤としてもちいられるGd(3+)-DOTA錯体を導入することを試みた。しかしながら、ペプチドのDOTA化の最適な条件を実用的な範囲で定めることが困難であった。そこで、われわれはGd(3+)-DOTA錯体によるMRIイメージングの代わりに、in vivo蛍光イメージングを目指した蛍光化コラーゲン様ペプチドを作成することとした。現在までに、アミノ末端にフルオレセインを結合した(Pro-Hyp-Gly)10の合成を終えている。今後、ラットをもちいたin vivoアッセイにこれを用いる。2)抗血小板薬への応用 ここでは、コラーゲン3重らせん構造を有する血小板作用薬について検討を行った。われわれは血小板上のコラーゲン受容体であるglycoprotein VI(GPVI)をターゲットとしてこれに結合するコラーゲン様ペプチドを探索した。その結果、GPVIに結合するコラーゲン様ペプチドを取得した。このペプチドは、in vitroにおいて、血小板凝集を促進するアゴニストであった。しかしながら、マウスを用いた経静脈投与では、血栓形成などGPVIのアゴニスト活性にもとづく顕著な生理作用は観察されなかった。

  • コラーゲンからの創薬研究

    2008年  

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    本研究では、①コラーゲンおよびヘパラン硫酸プログリカンに結合する血管新生阻害/神経栄養因子である色素上皮由来因子(Pigment epithelium-derived factor, PEDF)、②血小板上のコラーゲン受容体であるGlycoprotein VI (GPVI)、③ガス壊疽菌クロストリジウムがもつコラゲナーゼのコラーゲン結合ドメイン(Collagen-binding domain, CBD)の3種のコラーゲン結合タンパク質について、それぞれのコラーゲン認識機構を検討した。①PEDFのコラーゲン認識機構:アミノ酸残基特異的化学修飾を施したコラーゲンとの結合性、およびマトリックスメタロプロテアーゼにより断片化したコラーゲンとの結合性の情報から、PEDFが結合しうるコラーゲン上のアミノ酸配列を予測し、それに基づいてペプチドを化学合成した。合成ペプチドとPEDFとの結合を調べた結果、PEDFが認識するコラーゲン上の配列をひとつ同定することができた。②GPVIのコラーゲン認識機構:上記PEDF結合性ペプチドを含む多くの合成コラーゲン様ペプチドとGPVI細胞外ドメインとの結合を調べた。その結果、GPVIはPEDFと一部オーバーラップしたコラーゲン上の配列を認識して結合しうることが明らかとなった。③コラゲナーゼCBDのコラーゲン認識機構:コラゲナーゼCBDの立体構造については、既に結晶構造が解かれているので既知である。ここでは、コラーゲン上でCBDがどのように配向して結合しているのかを明らかにするために、CBDのNMRシグナルのペプチドによる常磁性緩和によるシグナル消去を利用した。具体的には、コラーゲン様ペプチドの様々な位置に常磁性のPROXYLを導入したものを調製し、これらとCBDとの複合体のHSQCを測定し、シグナルが消去されるアミノ酸残基を特定した。この解析の結果から、コラーゲン上でCBDが一方向に配向していることが明らかとなった.

  • コラーゲン様構造を基盤とした細胞内デリバリーツールの開発

    2008年  

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    本研究では、Arg-richなコラーゲン様ペプチドの細胞内移行性に必要な構造的要因の調査を目的とした。さらに、三重らせん上のArg側鎖の配向が細胞内移行性に与える影響についても検討した。配列中にD-Proを導入し三重らせんを形成できない三量体ペプチド、三重らせん上の同一方向にArg残基を配置したペプチド、および、Arg残基をばらばらに配置したヘテロ三量体ペプチドをデザイン・合成した。細胞内移行性は①Streptavidin-ZAPの細胞内への運搬、②共焦点レーザー顕微鏡および③FACS(蛍光セルソータ)により評価した。①Streptavidin-ZAPの細胞内運搬よる評価。まず、ペプチド鎖にビオチンを付加し、Streptavidin-ZAP (細胞毒性を有する)と混合して複合体を形成させた。その後、Streptavidin-ZAPとビオチン付加ペプチドの複合体含有培地中でHeLa細胞を培養し、ペプチド鎖に伴って細胞内に輸送されたサポリン(ZAP)が、細胞をどの程度死滅させたかをMTTアッセイで定量化した。②共焦点レーザー顕微鏡による評価。蛍光標識したペプチド含有培地中でHeLa細胞を培養後、共焦点レーザー顕微鏡による観察を行った。③FACSによる評価。蛍光標識したペプチド含有培地中でHeLa細胞を培養後、FACSにより蛍光強度を測定して、ペプチド鎖の細胞内移行性を定量化した。円偏光二色性スペクトル測定の結果から、ペプチドは37℃において分子デザインから期待された三次構造をとっていることを確認した。また、細胞を用いた実験の結果から、細胞内移行性は、三重らせん構造を形成しないペプチドよりも、Arg側鎖の位置を固定したペプチドの方が、優れていることがわかった。また、コラーゲン様ペプチドの細胞内移行性は、三重らせん上のArg側鎖の配向に依存し、Arg側鎖を同一方向に配置したペプチドはより効率的な細胞内移行を示すことが明らかになった。本研究から、コラーゲン様ペプチドの細胞内移行には、三重らせん構造形成によるArg側鎖の集積化が重要であり、また、三重らせん上のArg側鎖の分布密度が重要な役割を果たしていることが示唆された。

  • ペプチドー蛋白質結合インターフェイス解析のための新規光ラベル法の開発

    2007年  

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    ペプチド-タンパク質間の相互作用の解析法のひとつとして、photo-affinity labelingが用いられてきた。これまでに我々は、p-benzoylphenylalanine(Bpa)を含有するペプチドとタンパク質のphoto-affinity labelingにより、結合インターフェイスの同定を試みてきた。しかし、クロスリンク産物を酵素消化することによって生じるペプチド断片が大きいため、質量分析による構造解析が困難であった。そこで、本研究では、光反応性のアミノ酸として、Ser(O-p-benzoylbenzyl)(=Ser(BP))に着目した。このアミノ酸は切断可能なベンジル型側鎖官能基を有している。このため、クロスリンク産物からペプチド鎖を切り離すことにより、酵素消化後に生じるペプチド断片を小さくすることができるモデル系として、カルモジュリンとそれに結合する17残基のアミノ酸からなるペプチドを用いた。①Ser(BP)残基を組み込んだカルモジュリン基質ペプチドをFmoc固相法により合成した。②ペプチドとタンパク質の光クロスリンクを行い、tricine-SDS PAGEにより分析した。③ペプチドについて、トリフルオロメタンスルホン酸(TFMSA)/トリフルオロ酢酸(TFA)系でbenzoylbenzyl基切断反応を行い、逆相HPLCにより分析した。まず、Ser(BP)含有ペプチドはカルモジュリンとの特異的な結合に依存して、光架橋できることが確認できた。次に、Ser(BP)含有ペプチドをTFMSA/TFA処理した結果、Ser(BP)残基の側鎖benzoylbenzyl基が切断された。以上の結果より、Ser(BP)残基は、合成ペプチド中に組みこめて、タンパク質との間で光クロスリンクが可能であること、また、ペプチド中のSer(BP)残基の側鎖部分を酸により切断できることが明らかとなった。

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